抵抗素对雄性小鼠生殖功能的影响

刘小平， 张 庚， 刘 丹， 朱晓欢， 鲁兆轩，位 兰， 文凤云，2

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023；2. 洛阳市优质畜禽种质资源与遗传繁育重点实验室，河南 洛阳 471023)

0 引言

抵抗素是由白色脂肪细胞特异分泌的一种肽类激素，是具有激素样活性的抵抗素样分子的创始成员，在肥胖和代谢综合征等生理病理中起主要作用[1]。在饮食诱导的肥胖小鼠体内，将抵抗素敲除，发现小鼠肝脂肪变性，血清胆固醇和极低密度脂蛋白水平降低[2]。抵抗素与心血管疾病、动脉粥样硬化、类风湿关节炎、慢性肾脏病和高血压相关[3-5]。文献[6]研究表明：雄性小鼠肥胖组、动脉粥样硬化组抵抗素表达与血脂谱及炎症状态显著相关。其次，在肥胖个体的血清中观察到抵抗素水平升高[7-8]，大量证据表明：抵抗素水平升高与肥胖相关的恶性肿瘤之间也存在联系[9-10]。同时，抵抗素具有强有力的促炎特性，并直接或间接促进癌症进展[11-15]，血清抵抗素与胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌症等都有关[16]。

有研究表明：抵抗素存在于不同物种两性的各个生殖组织中，可能与肥胖相关的不孕症等相关[17]。同时，抵抗素在调节体重、中枢神经系统和生殖器官中也发挥着重要作用，它通过作用于中枢神经系统参与青春期的复杂过程并维持正常的生殖功能。大鼠睾丸间质细胞抵抗素的基因表达高于生精小管内的支持细胞，这种表达受促性腺激素、瘦素和营养状况的调节[18]。人类精液中的抵抗素水平高于血清，并且精液抵抗素与精子质量相关[19]。当研究不育患者体内抵抗素水平与脂质过氧化、过氧化氢酶活性之间潜在关系时，发现患者抵抗素水平与脂质过氧化、过氧化氢酶活性、精子凋亡和坏死呈正相关[20]。体外研究发现：抵抗素参与精子获能、精子和卵子融合以及受精[21]。

近年来，对人进行的抵抗素和肥胖相关的研究已经表明：与正常对照组相比，肥胖个体的抵抗素水平较高[7-8，22]，并且与体质量指数和内脏脂肪含量呈正相关[23-24]。进一步的研究发现，抵抗素循环水平在体质量下降时显著降低[25]。体质量超重也可能导致精子参数发生变化，其精子数量、流动性和活力不足可能导致生育率下降[26]，但这种体质量超重所造成的生育率下降是否与肥胖状态下高循环抵抗素水平相关目前还不清楚。本研究利用抵抗素重组蛋白，对雄性小鼠进行尾静脉注射模拟高循环水平抵抗素，通过小鼠血清生殖激素水平变化测定、精子活动能力检查、睾丸组织结构检测以及形态观察，以期阐明肥胖状态下抵抗素与雄性小鼠生殖功能的关系。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康雄性8周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF) C57BL/6J小鼠(10只)，体质量(20.0 ± 0.6) g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及处理

将试验小鼠随机分为试验组和对照组(n=5)，单笼单只饲养，随机采食和饮水，自然光照。每日定时称取体质量后进行尾静脉注射，试验组小鼠注射终浓度为400 ng/(d·只)的抵抗素溶液(PeproTehc，美国)[27], 对照组小鼠注射等体积双蒸水，连续注射6 d，注射完成当天断食断水12 h，第7天摘除眼球收集血清，同时测量血糖，然后脱颈处死进行样品采集。

1.2.2 精子的采集与处理

将处死的小鼠仰卧，用乙醇棉球消毒其腹部被毛及皮肤，确定开口位置，然后剪开小鼠腹部，进行睾丸附睾的处理，将一侧睾丸和附睾以及输精管用眼科剪分离，将睾丸横切为若干段或组织块，放入加有1 mL的5%(质量分数)葡萄糖磷酸缓冲盐溶液的表面皿中，用眼科剪轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，于37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养20 min，使精子自行散开。

1.2.3 小鼠血清生殖激素测定

通过摘眼球取血法采集血液于Eppendorf(EP)管内，静置后于离心机3 000～4 000 r/min离心10 min，取上层血清，在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 精子活力检查

用滴管吸取精液，将其滴入血球计数板与盖玻片接触处的计数室，使精液能够自然流入计数室中。进行计数，计数时选取中间5个中方格(即对角的5个方格或者四角及中间这5个方格)内80个小方格的精子数记为C。先计数死精子的数量，将其记为A，将计数板于50 ℃水浴锅放置10 min以便杀死精子，第2次计数精子总数为B，(B-A)/C为精子活力。计数时每只小鼠的精子用3个计数板重复计数3次，取其平均值。

1.2.5 精子形态观察

取适量精液滴在载玻片上，制成精子悬液涂片。用0.5%(体积分数)龙胆紫乙醇溶液染色3 min，自然干燥、水洗，在显微镜下观察精子的形态结构。

1.2.6 睾丸组织结构检测

处死小鼠并分离睾丸，快速放入戊二醛固定液或电镜固定液中，分别使用H & E染色和透射电镜技术观察组织结构的变化并拍照保存。

1.3 统计方法

本试验所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行分析处理，采用单因素方差的分析方法分析处理数据，结果用均值±标准误差表示，组间数据的显著性检验采用Dunnet’t法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 抵抗素对小鼠血清生殖激素质量浓度的影响

抵抗素对小鼠血清生殖激素质量浓度的影响如表1所示。由表1可知：试验组小鼠血清内雌二醇(estradiol，E2)质量浓度和睾酮(testosterone，T)质量浓度均显著高于对照组小鼠的(P<0.05)；试验组小鼠血清促卵泡成熟素(follicle-stimulating hormone，FSH)的质量浓度有所降低，但差异不显著(P>0.05)；试验组小鼠血清促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的质量浓度与对照组相比，有所升高，但差异不显著(P>0.05)。

表1 抵抗素对小鼠血清生殖激素质量浓度的影响

2.2 抵抗素对小鼠精子质量的影响

抵抗作用后小鼠精子活力及畸形率的检测结果分别如表2和表3所示。表2表明：与对照组相比，试验组小鼠的精子活力显著下降(P<0.05)。表3表明：与对照组相比，试验组小鼠精子畸形数量更多，畸形率略有升高，但差异不显著(P>0.05)。

表2 抵抗素作用后小鼠精子活力的比较

表3 抵抗素作用后小鼠精子畸形率的比较

2.3 抵抗素对小鼠精子形态的影响

图1显示对照组与试验组小鼠龙胆紫染色精子的正常形态及畸形精子的形态。正常精子的形态像蝌蚪一样，头部呈椭圆形，颈部与尾部相连接，由一条轴丝相连，尾部有鞭毛状形态(见图1a)；畸形精子出现头部膨大、瘦小、缺损、轮廓不明显，颈部膨大、不全分叉，尾部曲折、卷曲、断裂短小等现象。与对照组相比，试验组小鼠出现畸形精子数目显著增加(见图1b)。

(a) 对照组

2.4 抵抗素对小鼠睾丸组织结构的影响

在对小鼠睾丸组织样本进行H & E染色后，在光镜下以不同放大倍数观察对照组小鼠睾丸组织样本(见图2和图3)，发现：对照组小鼠曲精小管直径较大，管腔相对较小，含有大量排列规则的生精细胞，层次较分明，由基膜向内依次是精原细胞、初级精母细胞、精子细胞和精子，精原细胞与基膜最接近，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央，且精子数目较多。除此之外，还能看到底部附着于基膜的支持细胞，其细胞核形状不一(见图2a和3a中箭头所指)。试验组小鼠曲精小管直径小于对照组，但统计学分析显示差异不显著(P>0.05)，管腔相对较大，含有的生精细胞数目、层数相对较少，排列不规则，或出现排列断裂等现象。在对照组与试验组小鼠的睾丸组织样本中均未观察到明显的次级精母细胞，除此之外，试验组与对照组的基膜没有观察到明显的差异对比(见图2b和图3b中箭头所指)。

(a) 对照组(b) 试验组

(a) 对照组(b) 试验组

2.5 抵抗素处理后小鼠睾丸超微结构变化

抵抗素处理后小鼠睾丸超微结构变化如图4所示。对照组小鼠的睾丸组织样本中能够看到形态结构正常、与基膜连接紧密的支持细胞，核仁清晰可见，形态规则，结构清楚，染色质集中分布，相邻支持细胞之间相互连接，精原细胞核膜光滑，未出现明显的凹陷或变形，可以明显观察到核膜的双层膜结构，视野中有数目丰富、结构正常的线粒体，多于试验组，且能观察到清晰的线粒体脊(见图4a)。试验组小鼠的核膜出现了不同程度的凹陷、变形，胞质出现部分空泡状结构，核膜的双层膜结构不完整，出现部分缺损，滑面内质网数目较多，线粒体数目较少，且线粒体出现了一定程度的变形，线粒体嵴发生溶解，很难观察到结构清晰的线粒体嵴，高尔基体清晰可见，但支持细胞与对照组相比没有观察到明显的结构变化，无显著差异(见图4b中箭头所指)。

(a) 对照组

3 讨论

抵抗素是在多种激素及营养调控下脂肪细胞分泌的一种肽类激素。文献[28]发现：抵抗素信使核糖核酸的表达受年龄的影响，出生45 d的小鼠激素水平最高，此后下降；雄性大鼠的抵抗素信使核糖核酸比雌性大鼠的高，对切除不同年龄大鼠的卵巢和睾丸试验研究发现，性激素增加雄性大鼠脂肪组织中抵抗素信使核糖核酸的表达。这表明抵抗素可以解释青春期胰岛素敏感性下降，可能是由于性类固醇与胰岛素敏感性之间的联系[29]。也有研究表明： 血清抵抗素水平与促甲状腺激素呈负相关, 与游离T3 (FT3) 、FT4水平呈正相关[30-31]。本试验将抵抗素重组蛋白通过尾静脉注射处理小鼠，结果发现试验组小鼠的血清E2质量浓度和T质量浓度均显著高于对照组小鼠的(P<0.05)，试验组小鼠血清FSH质量浓度和LH质量浓度差异不显著(P>0.05)，这与文献[28]的研究结果一致。

在肥胖小鼠体内，血清抵抗素水平显著上升，且血清抵抗素水平与机体胰岛素抵抗程度呈正相关。有研究发现：高脂饮食诱导的肥胖能够导致F0代和F1代小鼠精子形态畸形率显著增加，小鼠精液参数异常，精子活力和密度降低，精子质量下降，同时小鼠睾丸和精子超微结构异常，造成雄性小鼠遗传性的生殖功能的下降[32]。本试验中试验组雄性小鼠的精子活力显著下降，小鼠精子畸形数量更多，畸形率相对略有升高，同时小鼠精子形态异常。睾丸组织样本中试验组小鼠曲精小管直径小于对照组，管腔相对较大，含有的生精细胞数目、层数相对较少，排列不规则。试验组小鼠睾丸出现超微结构病变，与对照组相比出现了不同程度的凹陷、变形，胞质出现部分空泡状结构，核膜的双层膜结构不完整，出现部分缺损，滑面内质网数目较多，线粒体数目较少，且线粒体出现了一定程度的变形。结果表明：抵抗素对小鼠睾丸和精子的超微结构以及精子相关参数产生了显著影响。

4 结束语

本研究利用抵抗素重组蛋白进行雄性小鼠尾静脉注射，模拟高循环水平抵抗素状态，观察其对雄性小鼠生殖功能的影响，结果表明试验组小鼠血清E2质量浓度和T质量浓度均显著高于对照组小鼠的，且精子活力显著下降，精子形态异常，睾丸出现超微结构变化，提示抵抗素能够引起雄性小鼠血清生殖激素水平的变化，导致雄性小鼠生殖功能下降。