油菜矮秆相关基因定位克隆及其在育种中的应用

王小川,李 昕,阎晋东,张 慧,赵小英

(湖南大学生物学院植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室湖南省杂交油菜工程技术研究中心,中国湖南 长沙 410082)

油菜是一种重要的油料作物,其株高严重影响作物的抗倒能力、产量和机械化收割。甘蓝型油菜倒伏导致种子重量下降11%,收获指数下降3.3%[1]。同时,倒伏后的油菜难以收割,使损失更加严重。矮秆及半矮秆株型油菜品系选育有利于提高植株抗倒伏能力和收获指数[2]。作物矮化大多与植物激素生物合成或信号转导途径有关,其中与赤霉素(gibberellin,GA)和油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)相关的研究较多,与生长素(auxin)相关的研究比较少[3]。在小麦和水稻中,研究人员已成功分离、克隆出矮秆基因并将其应用在育种中,取得了“绿色革命”的巨大成功[4～6]。目前,科研工作者已发现和创制了多个油菜矮秆材料,并对部分矮秆基因进行了定位克隆。本文就油菜矮秆相关基因定位克隆及其应用研究进展进行综述。

1 赤霉素相关油菜矮秆基因定位克隆

GA是控制植物株高的重要植物激素,GA信号缺陷导致植物变矮。近20年来,多个与GA信号相关的油菜矮秆基因被分离和鉴定(表1)。1995年,Foisset等[7～9]通过甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变“Primor”品种,筛选到一个矮秆突变体bzh。该突变体的矮秆性状受单基因控制,矮秆相关基因Bzh定位于A6染色体上。经EMS诱变获得的半矮秆突变体ds-1[10～11]由单个部分显性基因BnaA6.rga-ds控制,其与Bzh互为等位基因,编码GA信号抑制子RGA(repressor of ga l-3)蛋白。在突变体RGA蛋白的DELLA结构域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸突变为亮氨酸(序列突变为VHYNL),致使突变体对GA不敏感,油菜株高变矮。与ds-1类似,EMS诱变双低品种HS5获得的矮秆突变体ds-3[12]对GA的敏感性降低,它受半显性基因BnaC07.RGA控制,在该基因编码的RGA蛋白的DELLA结构域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸也突变为亮氨酸,导致RGA不能与GA受体GID1(GA-insensitive dwarf 1)相互作用,GA信号转导受阻,RGA蛋白积累,最终植株矮化。白菜型油菜矮秆突变体dwf2[13～14]也是一个GA不敏感突变体,突变体中RGA基因编码的DELLA蛋白C末端GRAS保守区域的第328位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R),致使RGA不能与E3泛素连接酶SCFSLY1相互作用,RGA蛋白降解受阻,GA信号减弱,植株变矮。经硫酸二乙酯(diethylsulfate,DES)与快中子照射联合处理得到的矮秆突变体ndf-1[15～16]对GA也不敏感,在该突变体中,编码GA受体的BnGID1基因启动子嘧啶盒(P-box)序列有3个碱基发生突变(两个TT突变为CC,1个G缺失),从而影响了BnGID1的正常表达,导致GA信号减弱,进而使植株变矮。因此,GA信号受体GID1或者GA信号关键抑制子DELLA家族蛋白RGA的量发生变化,都会影响GA信号的正常传递,进而控制油菜株高。

表1 油菜矮秆突变体及相关基因Table 1 Dwarf mutants and related genes of Brassica napus

此外,宋稀等[17]在田间获得一个自然矮化突变体dw-1,其平均株高为95 cm,由1对加性-显性主基因控制,并已被证明是GA响应减弱类型突变体。Zeng等[18]通过EMS诱变从甘蓝型油菜自交系T6中获得一个矮秆突变体bnaC.dwf。该突变体受1对隐性基因控制,对外源GA3处理不敏感,表明其GA信号转导存在缺陷。目前,dw-1和bnaC.dwf矮秆性状相关基因尚未定位克隆。

GA代谢过程发生变化也会影响植物株高。GA代谢途径中的赤霉素2-氧化酶(GA 2-oxidase,GA2ox)能通过β-羟基化作用将活性GA1和GA4催化,形成无活性GA8和GA34,降低生物活性GAs的含量,进而影响植物株高。近几年,课题组从甘蓝型油菜中分离了两个GA2ox基因BnGA2ox6和BnGA2ox2,发现BnGA2ox6异源表达到拟南芥中能够使转基因植株表现出GA缺乏表型,幼苗下胚轴变短,成年植株变矮;经外源GA3处理,植株又能够恢复幼苗下胚轴长度和株高[19]。与Bn-GA2ox6类似,BnGA2ox2在拟南芥和油菜中异源表达或者过量表达时,导致拟南芥和油菜幼苗及成年植株矮化;喷施外源GA3也能够恢复转基因植株表型[20]。这些研究结果表明,BnGA2ox6和BnGA2ox2是两个新的油菜矮秆相关基因。

2 生长素相关油菜矮秆基因定位克隆

生长素也是控制植物株高的主要植物激素之一。近年来,科研工作者陆续发现了多个与生长素信号转导相关的矮秆突变体,并定位克隆了矮秆性状相关基因(表1)。Zhao等[21]在“矮源1号”小孢子培养过程中获得一个矮秆突变体ds-4,其成熟期株高为23 cm左右,受半显性基因BnaC05.IAA7控制。该基因编码生长素信号负调节子AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)蛋白 IAA7,突变体中AUX/IAA7蛋白保守区域第87位的脯氨酸突变为亮氨酸(序列GWPPV突变为GWLPV),使生长素诱导的AUX/IAA7与生长素受体TIR1(transport inhibitor response 1)的相互作用受到抑制,导致IAA7不能被降解而积累,植株茎的伸长生长受抑制而变矮。EMS诱变矮秆突变体sca[22]的株高为76 cm左右,受半显性基因BnaA3.IAA7控制。该突变体IAA7蛋白第84位的甘氨酸突变为谷氨酸(序列GWPPV突变为EWPPV),破坏了保守结构域,降低了生长素诱导的BnaA3.IAA7与TIR1的亲和力,抑制了低浓度生长素条件下BnaA3.IAA7蛋白降解和信号转导,从而降低了油菜株高。显性矮秆突变体g7[23]也可能与生长素信号受阻有关,其矮秆基因定位在C5染色体的0.6 Mb区间内,其中一个单核苷酸突变(G-A)使Bna.IAA7.C05编码蛋白IAA7第89位甘氨酸突变为谷氨酸,即保守序列GWPPV突变为EWPPV,这可能与矮秆表型有关。课题组前期已将EMS诱变突变体 bnd2(Brassica napus dwarf 2)[24～25]的矮秆性状相关基因BND2定位在A8染色体15.62 Mb至15.76 Mb的140 kb区间,该区域内有27个候选基因,其中BnaA08g20960D基因第5个内含子中存在一个单碱基突变(C-T),使得BnaA08g20960D的表达量降低。该基因与拟南芥编码肌醇1,3,4,5,6-五磷酸-2激酶的AtIPK1基因同源,AtIPK1催化肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸(inositol hexakisphosphate,InsP6)生物合成中的最后一步[26]。InsP6已被证明是生长素受体TIR1的辅酶,能够稳定TIR1蛋白构象,保证生长素有效地与TIR1活性位点结合,引发生长素响应[27～29]。因此,我们推测BnaA08g-20960D是BND2的候选基因,目前正在开展遗传学验证实验。

此外,Zheng等[30]发现了一个自然矮秆突变体ed1,该突变体受一个半显性基因控制,成熟期株高为23 cm左右,叶片卷曲。研究人员初步证明ed1是一个IAA/BR不敏感突变体,与IAA信号途径有关。这为ed1矮秆性状相关基因的定位提供了线索。

3 其他油菜矮秆突变体

浦惠明等[31]研究的甘蓝型油菜矮秆品种“矮源1号”在成熟阶段平均株高约为24 cm,矮秆性状呈显性。自然矮秆突变体99cdam[32]的株高约为85 cm,受3对隐性基因控制。矮秆突变体bndf-1[33]的株高约为75 cm,株型紧凑,矮秆性状受单显性基因控制。EMS诱变矮秆突变体bndwf1[34]的成熟期株高为80～110 cm,受单显性基因控制;bndwf1突变体基因定位于A9染色体152 kb区间内,该区间包含14个注释或预测的基因,其中7个可能与bndwf1的矮秆表型有关。EMS诱变矮秆突变体bndwf/dcl1[35]的株高为40～70 cm,受单显性基因控制,该突变体基因定位于C5染色体175 kb区间内。矮秆新材料dw871[36～38]的株高性状由1对显性主基因控制,后者初步定位在A10染色体1.83 Mb区间内;该株系矮秆单株后代品质表现为双低和杂黄籽,其丰产性与同源高秆品系相当,是甘蓝型油菜新型矮秆种质资源。王伟荣等[39]在航空诱变甘蓝型油菜品种“0602”“0607”“沪油12”“沪油14”和“沪油16”的后代中也发现了矮秆新材料。这表明航天诱变也是选育新品种的一条有效途径。需要指出的是,上述矮秆突变体是否与GA、IAA、BR等植物激素生物合成或信号转导有关尚不明确。

4 油菜矮秆基因应用研究

大量育种实践表明,适当的株高对于提高抗倒性和产量尤为重要。傅廷栋[40]认为,半矮秆抗倒伏材料能使收获速度增加25%;关周博等[41]提出,适合机械化收割的油菜品种一般以1.5～1.7 m株高为宜。近年来,科研工作者利用矮秆基因育成了一系列具有潜在应用价值的抗倒品种(系)、不育系和杂交组合。Wang等[42]将矮秆基因NDF-1转育到双低甘蓝型油菜品系中,育成了矮秆双低品系ddf-1和ddf-2,其单株种子产量、收获指数和生物量都有了显著的提高。ddf-1与高秆品系杂交获得的F1植株株型理想,超亲优势率高达30%～40%。此外,该团队利用NDF-1矮秆基因育成的矮秆核不育两用系与高秆优良品系杂交,选育出了半矮秆抗倒、耐肥、耐密植且高产的强优势杂交组合。另有研究人员将白菜型油菜矮秆突变体dwf2(brrga1-d)等位基因导入株型高大、易倒伏的甘蓝型油菜中,显著降低了株高,提高了抗倒伏性,且对油菜产量无明显影响[14]。将矮秆突变体bndf-1与其他亲本杂交,获得的杂种F1的株高也显著降低,同时产量也无显著影响[33],提示该突变体具有较好的应用前景。将油菜矮秆突变体sca与油菜品种4312、ZS11和ZY821配组,获得的杂交F1植株株高介于两个亲本之间,并且单株产量显著高于两个亲本[22],表明这些杂交组合具有较强的产量杂种优势。张瑞茂等[36～37]利用新选育的dw871矮秆材料开展了两项转育工作,一是将dw871矮秆直立株型转育到现有的高秆甘蓝型油菜品种,成功获得了大量的矮秆直立株型常规品系;二是进行甘蓝型油菜隐性核不育三系的转育,获得3份不同来源的甘蓝型油菜隐性核不育三系,实现了三系配套。他们提供的多个矮秆直立株型甘蓝型油菜新组合已在长江流域各省区市进行多点试验与示范。最近,课题组将矮秆突变体bnd2与高秆品种L329杂交,发现杂交F1与L329相比,株高没有增加,但是单株产量增加,提示bnd2可用于甘蓝型油菜抗倒伏和高产杂交育种[25]。这种矮秆性状并不影响杂种优势的表现,并且以矮秆为母本,以高秆为父本,更有利于杂交制种。因此,矮秆基因在油菜杂交育种中具有极好的应用前景。

5 展望

尽管在甘蓝型油菜中已经报道了多个矮秆突变体材料,定位克隆了多个矮秆基因,但由于与产量相关的其他农艺性状受影响,所以产量降低,目前只有少数材料可用作实际育种资源。因此,选育具有育种应用价值的矮秆材料和定位克隆矮秆基因,仍然是未来的一个研究方向。

近年来,随着参考基因组研究和高通量测序技术(next generation sequencing)发展,基于高通量测序技术与混合样本分组分析(bulked segregant analysis,BSA)相结合的方法,即BSA-seq,加速了重要性状相关基因的克隆。该方法已被成功地用于定位克隆油菜矮秆基因[25]。此外,新发展的油菜60K单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片可以用来快速对甘蓝型油菜进行全基因组基因分型,以及快速鉴定与目标基因相关的SNP位点;油菜60K SNP芯片结合BSA方法可快速鉴定与目标基因连锁的区段[43]。Hu等[44]将油菜60K SNP芯片与BSA分析相结合,在甘蓝型油菜中鉴定出与裂叶相关的31个SNP,并通过传统连锁分析对这些位点进行了验证。Li等[45]利用油菜SNP芯片和BSA分析,鉴定出两个控制油菜分枝形成的主效数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)。这些生物技术手段和方法的综合应用,将进一步提高油菜重要农艺性状相关基因的定位克隆效率。

矮秆油菜在生产上具有巨大的应用价值,也是研究基因表达调控的重要材料。对自然或人工诱变的矮秆突变体的矮秆基因进行定位和克隆,将为培育丰产稳产、适宜机械化栽培的矮秆油菜品种提供理论依据。