杜鹃叶片表皮毛特征对杜鹃冠网蝽寄主选择的影响

毛 静，杨 品，2，周 媛，童 俊，徐冬云

(1.武汉市农业科学院林业果树研究所，湖北武汉 430075；2.华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉 430070)

杜鹃是杜鹃花属(Rhododendron)植物的统称，泛指杜鹃花科杜鹃花属植物，是世界上著名的观赏花卉，也是我国传统的十大名花之一，因其花色艳丽、绿叶鲜亮、充满野趣等特点备受人们喜爱。病虫害的防治在杜鹃繁育栽培过程中尤为重要，其中以杜鹃冠网蝽(Stephanitispyriodes)的危害最为严重和普遍。杜鹃冠网蝽是半翅目(Hemiptera)网蝽科(Tingidae)杜鹃冠网蝽属(Stephanitis)昆虫，能危害杜鹃花亚科杜鹃花属的大部分杜鹃种或园艺栽培品种。杜鹃冠网蝽以成虫和若虫在叶背上密集取食和排泄粪便，导致叶片锈黄，叶片正面出现白色斑点，影响杜鹃叶片光合作用，从而导致叶片提前脱落，植株生长不良，降低了其观赏价值。

植物表皮毛状体是由表皮细胞发育形成的一种具有特殊结构的毛状附属物[1-2]，它与植物抗虫能力存在密切关系[3-4]。一般非腺体表皮毛可通过其形体机械式地限制阻隔害虫在植物体表面的侵害，而有腺毛状体则用其分泌的黏液或毒素，来扰乱、诱捕或致死害虫[5]。同时，叶片表皮毛的分布与形态特征也因植物的属种差异表现出一定的异同性[6-7]。在杜鹃属的分类与种间关系问题方面，叶片表皮毛的有无与微观形态特征一直都是重要鉴别指标[8-9]。植食性昆虫对寄主植物存在选择偏好性[10-11]。杜鹃冠网蝽对不同品种杜鹃叶片的危害程度差异明显[12]。有研究表明，杜鹃冠网蝽的取食偏好性与叶片面积、叶绿素含量以及叶表毛状体密度等因素显著相关[13]。而不同杜鹃品种叶片上覆盖有不同形态和密度的毛状体，叶表毛状体形态特征和密度差异是否影响杜鹃冠网蝽的取食选择偏好性尚不明确。本研究通过对不同杜鹃品种叶片的表皮毛微观结构比较观测，分析杜鹃不同形态的表皮毛与杜鹃冠网蝽取食偏好性之间的关系，以期为杜鹃叶片表皮毛功能研究提供参考，丰富杜鹃生物胁迫的抗性研究内容。同时，研究不同品种叶片表皮毛特征并比较其抗虫功能差异，可为以后在分子水平上分离杜鹃表皮毛或腺毛发育的关键基因，利用其改良低抗虫性杜鹃品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试杜鹃：选取“胭脂蜜”“杨贵妃”“紫鹤”“泰勒”4个杜鹃品种，采用口径为24 cm、高19.5 cm的塑料盆栽苗，植株冠幅为50 cm×60 cm左右，盆栽基质为泥炭土 ∶树皮 ∶珍珠岩=1 ∶1 ∶1(体积比)，盆栽苗均置于武汉市农业科学院杜鹃种质资源圃。

供试虫源：杜鹃冠网蝽，从武汉市农业科学院杜鹃种质资源圃中收集而来，于人工气候箱(光—暗周期为14 h—10 h，温度为25 ℃，相对湿度为80%)中培养3代以上。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片表皮毛观测与密度统计 体视荧光显微镜观察：2021年4月中旬于武汉市农业科学院杜鹃种植资源圃，分别取不同品种杜鹃枝条上第1轮新叶、第2轮成熟叶与第3轮老叶，采用直径为 8 mm 的打孔器，沿主脉取叶片中部位置叶盘，置于奥林巴斯显微镜(SZX2-ILLT)自然光、蓝光紫外荧光下观察。叶片应尽量展平，在视野中观察表皮毛形态结构，拍照记录，并统计每张叶片盘上的表皮毛数量。每轮叶片分别选取3张用于密度统计。表皮毛密度(个/mm2)=所观测视野中的表皮毛数量总和/视野面积。

扫描电镜观察：2021年4月中旬，在武汉市农业科学院资源圃挑选无虫害植株，并选择健康叶片。沿主脉将叶片切成约1 cm2的正方形，观察面尽量平整，同时要注意避免镊子挤压等机械损伤，保护扫描面；将切下的叶片放入4 ℃预冷的2.5%戊二醛中固定过夜，然后吸出固定剂，用0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)浸洗3～5次，每次15 min；然后用系列梯度乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%)逐级脱水，每次15 min，再用100%乙醇溶液彻底脱水2次，每次10 min；将样品放入德国徕卡临界点干燥仪(EM CPD300)干燥后，用德国徕卡离子溅射镀膜仪(EM ACE200)均匀喷镀，完成后用日立扫描电镜仪(SU-8010)观察表皮毛并拍照记录。

1.2.2 杜鹃冠网蝽取食选择偏好性测定 杜鹃冠网蝽取食偏好性试验于2021年4月中旬在武汉市农业科学院林业果树研究所植物生理实验室开展。采用直径为15 mm的打孔器，沿主脉取叶片中部位置叶盘，置于铺垫湿润滤纸的玻璃培养皿上。将10头杜鹃冠网蝽幼虫饥饿处理8 h后，放置培养皿中心位置，任其在2个品种杜鹃叶盘间选择取食，分别在0、1、2、4、6、24 h记录不同品种杜鹃叶片上取食的杜鹃冠网蝽幼虫数量。相同的方法改变叶片左右方位并在每个方位上重复5次。

1.3 数据分析

采用SPSS 25.0进行数据分析。不同杜鹃品种间差异用Duncan’s新复极差法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同品种杜鹃叶片表皮毛形态特征比较

2.1.1 自然光与紫外荧光下杜鹃叶片表皮毛形态特征 在体视显微镜的可见光下，不同品种杜鹃叶片上的表皮毛呈现不同的形态(图1)。在相同的放大倍率视野下，“胭脂蜜”叶片表皮毛明显呈直线长发状，叶脉处的毛状体较短且粗壮(图1-A、图1-B)；“杨贵妃”叶片表皮毛与“紫鹤”相近，都为直线发状，但单个毛状体较“紫鹤”的短且细软(图1-D、图1-E)；“紫鹤”的表皮毛粗壮且笔直，朝向基本一致，叶脉上的毛状体也较为密集(图1-G、图1-H)；“泰勒”叶表与叶脉都覆盖黑色弯曲状毛状体且更为浓密蓬乱，其头部或中部呈弯曲状，长短不一，毛状体朝向不整齐(图1-J、图1-K)。

不同品种的叶片表皮毛形态差异在荧光激发下更为明显。在蓝光紫外荧光下，叶片中的叶绿素在紫外光下反射红色背景，表皮毛因细胞内叶绿素含量较少，呈现黄色或黄绿色。不同品种之间的叶片表皮毛除了有覆盖密度、粗细以及柔软程度的差异外，还观察到腺体组织形态的差别。在“胭脂蜜”“杨贵妃”“紫鹤”3个品种的叶片上均发现了形态相似的头状腺毛，其顶端与直线发状毛状体明显不同，呈圆形或椭圆形。“胭脂蜜”叶片上头状腺毛最为密集；“杨贵妃”叶片上的腺毛较少，但其单个头状腺毛较大；“紫鹤”的头状腺毛较为细小(图1-C、图1-F、图1-I)。“泰勒”叶片上的腺毛在荧光下不仅密度较大且形态上呈管筒状，头部呈长椭圆形且较小，但柄状基部较长(图1-L)。在紫外荧光下还发现，不论是直线发状毛状体、头状或是管筒状腺毛，受紫外荧光激发后，杜鹃叶片上能呈现不同的颜色。部分表皮毛呈现暗红色，或因其细胞中含少量叶绿素；头状腺毛在荧光下主要呈现为黄色或金黄色，且亮度各异，可能因其腺毛处在不同的发育阶段，或是头状腺毛中内含物发生了复杂的生物合成或分泌等过程，导致荧光颜色差异。

2.1.2 不同发育阶段叶片表皮毛形态差异 为进一步获得杜鹃叶片毛状体的形态特征，不同杜鹃品种第1轮新叶、第2轮成熟叶与第3轮老叶进行扫描电镜观察。由图2可知，“胭脂蜜”新叶和成熟叶片上都可见清晰的直线发状腺毛(图2-A、图2-B)，而老叶上毛状体明显减少；头状腺毛在新叶上尚未饱满，直至成熟叶片上可见腺毛顶部逐渐充盈；老叶上部分腺毛呈现已释放出内含物后的凋萎状态，而尚未释放内含物的腺毛则十分饱满(图2-C)。在电镜相同放大倍率下“杨贵妃”叶片表皮毛较“胭脂蜜”的细(图2-E)，其头状腺毛较大，尤其是腺毛头部的分泌组织明显大于“胭脂蜜”(图2-H)。“杨贵妃”的新叶、成熟叶与老叶上发状表皮毛的覆盖密度在电镜下差异不明显，但其头状腺毛在新叶、成熟叶上呈倒伏状，充盈状态的腺毛主要集中出现在老叶上(图2-G)。“紫鹤”的3轮叶片上都可见清晰的直线发状表皮毛与头状腺毛(图2-I、图2-J、图2-K)，但老叶上的表皮毛明显少于新叶、成熟叶。头状腺毛状态因叶片不同发育阶段差异更为明显；新叶上的头状腺体大部分开始充盈，至成熟叶片腺毛头部组织已十分饱满；而在老叶上的腺毛则大部分呈释放内含物后的折倒状态。“泰勒”叶片上以新叶上弯曲的发状表皮毛最多，成熟叶片与老叶上发状表皮毛明显减少，取而代之的是管筒状腺毛(图2-M、图2-N、图2-O)。新叶上的腺毛头部分泌组织有部分尚未发育成熟，有一部分已充盈；成熟叶片上，可见部分腺毛直立且分泌组织充盈饱满，但有一部分已呈释放状态；老叶上的腺体头部则已开始凋萎。“泰勒”的腺毛比其他3个杜鹃品种的头状腺毛要长(图2-P)，且分泌内含物后虽头部萎缩但直立不倒伏，可能因其内部细胞组织构成更为坚挺。

2.1.3 不同品种杜鹃叶片表皮毛密度比较 在显微镜下观察发现不同品种杜鹃叶片表皮毛覆盖密度各不相同，同一杜鹃品种的新叶、成熟叶、老叶，以及叶片上下表皮的毛状体密度均存在差异。“泰勒”成熟叶、老叶的正面表皮毛密度显著高于其他3个品种；但其自身新叶、成熟叶与老叶之间差异不大。“杨贵妃”新叶正面表皮毛密度最大，但随着叶片的发育伸展，其老叶上的表皮毛密度明显下降。“胭脂蜜”“紫鹤”叶片正面表皮毛密度较为接近，皆为新叶上较大而在老叶上略有下降(图3-a)。比较杜鹃叶片背面表皮毛密度，“泰勒”3轮叶背的表皮毛密度都显著高于其他3个品种，而“胭脂蜜”叶背表皮毛密度最低。除“紫鹤”新叶上表皮毛密度明显高于其成熟叶与老叶外，其他杜鹃品种新老叶片上的表皮毛密度无显著差异，可能是在叶片发育生长过程中叶背有新的表皮毛生成(图3-b)。综合分析叶片正、背面表皮毛总数，4个品种杜鹃仅新叶的表皮毛密度差异达到显著水平(图3-c)。“泰勒”新老叶片之间差异不大，但都显著高于其他杜鹃品种。“胭脂蜜”的3轮叶片之间表皮毛密度差异未达到显著水平，而“杨贵妃”各轮叶片的表皮毛密度差异显著；“紫鹤”新叶上的表皮毛密度显著高于其成熟叶片与老叶，但其成熟叶与老叶之间差异不明显。

2.2 杜鹃冠网蝽对不同品种杜鹃叶片的取食选择

杜鹃叶片正面表皮毛密度大于叶背面，因此，首先验证杜鹃冠网蝽对杜鹃叶片正面与叶片背面的选择取食偏好。以“紫鹤”为材料，接种2 h开始，超过50%的杜鹃冠网蝽选择了叶片背面取食，6 h后，85%的杜鹃冠网蝽停留在了叶片背面。由此可见，杜鹃冠网蝽偏向寄生于杜鹃的叶片背面(图4-a)。其次进一步比较杜鹃冠网蝽是否会因新老叶片及其表皮毛密度差异而产生取食偏好行为。试验结果显示，1 h时约有50%的杜鹃冠网蝽尚游离在叶片之外，未进行选择；停留在新叶与老叶上的虫数差异不大；2 h开始，约42%的杜鹃冠网蝽选择了老叶；之后越来越多的杜鹃冠网蝽在老叶上取食，直至24 h时，90%的杜鹃冠网蝽选择停留在老叶上。因此，杜鹃冠网蝽偏向于在老叶上取食(图4-b)。

不同品种杜鹃叶片表皮毛形态与密度亦存在差异，因此将“胭脂蜜”“杨贵妃”“紫鹤”与“泰勒”的成熟叶片进行两两比较，观察杜鹃冠网蝽在2个不同杜鹃品种叶片之间的取食选择。将杜鹃冠网蝽放在“泰勒”“紫鹤”叶片间，1 h时66%的杜鹃冠网蝽在2个品种叶片外游离，此后陆续有杜鹃冠网蝽分别爬至2个品种叶片上，至24 h时有61%的杜鹃冠网蝽停留在“紫鹤”叶片上取食(图5-a)。当为杜鹃冠网蝽提供“泰勒”与“胭脂蜜”的叶片时，2 h 时有51%的杜鹃冠网蝽停留在“胭脂蜜”叶片上；24 h时有70%的杜鹃冠网蝽选择取食“胭脂蜜”叶片(图5-b)。而在“泰勒”与“杨贵妃”之间，1 h时有83%的杜鹃冠网蝽游离在叶片之外，2 h之后虽然开始陆续有杜鹃冠网蝽选择叶片进行取食，但在这2个品种的叶片上停留的虫数差异不大；24 h时分别有46%与43%的杜鹃冠网蝽选择“泰勒”与“杨贵妃”叶片取食(图5-c)，杜鹃冠网蝽的取食分布比较均衡。在“紫鹤”“胭脂蜜”之间，杜鹃冠网蝽偏向取食“紫鹤”叶片；在接种2 h时就有41%的杜鹃冠网蝽停留在“紫鹤”上，24 h时64%的杜鹃冠网蝽停留在“紫鹤”叶片上取食(图5-d)。

3 讨论与结论

一般认为植物体表面覆盖的毛状体具有抵御生物胁迫的物理作用，可以阻碍昆虫的自由移动，在一定程度上对害虫的取食造成阻碍[14-15]。杜鹃冠网蝽多选择老叶背面寄生，应与杜鹃叶片背面表皮毛密度小于正面且老叶表皮毛少于新叶相关。此外，表皮毛的形态特征也可以影响昆虫的行动，与抵御生物胁迫存在一定关系[16]，如西番莲利用其钩状毛，使钩住的纯蛱蝶幼虫因饥饿和失水而死，并且缺乏钩毛的同属植物上的纯蛱蝶幼虫的危害要严重得多[17]。本研究中“紫鹤”的新叶表皮毛因密集且细柔，能阻碍杜鹃冠网蝽的取食与攀爬；“泰勒”叶片表皮毛不仅高度密集，且弯曲柔软，长短不一，朝向不整齐，从而降低杜鹃冠网蝽的取食选择效率。

但也有学者提出，植物叶面表皮毛不仅可以形成稳定的小气候环境，还能辅助害虫更加稳固地攀爬在植物体上，帮助害虫掩藏寄生不被其天敌发现捕食[18]，如小麦叶片上简单直立生长的表皮毛对螨的栖居有利，且随着表皮毛密度越高相应着生螨的数量越多[19]。有研究表明，杜鹃冠网蝽在饥饿状态下偏向于快速找到食物并附着取食，故杜鹃叶背毛状体越多越利于杜鹃冠网蝽的快速附着取食[13]。本研究中也发现杜鹃叶片毛状体覆盖率较大的品种其抗虫性并不可观，如“紫鹤”，其成熟叶片背面表皮毛密度显著高于“胭脂蜜”，但杜鹃冠网蝽偏向选择在“紫鹤”叶背上取食，可能其叶背上的表皮毛更为直立粗壮，且头状腺毛数量相对较少，因此更有利于杜鹃冠网蝽的附着与取食；“杨贵妃”叶片表皮毛密度并不大，但毛状体较细软，不利于杜鹃冠网蝽的攀爬行动，故而有相对较少的杜鹃冠网蝽选择这个品种的叶片取食。在虫害观察中还发现，在毛状体密度较高且粗壮的部位，如叶片背面的叶脉处，亦是杜鹃冠网蝽偏好取食寄生的位置。故推测杜鹃冠网蝽的取食行为与杜鹃叶片表皮毛形态、质地也存在相关性。

杜鹃叶片上还存在具分泌功能的腺毛组织。许多植物腺体的分泌物都具有帮助植物更好地适应环境和防止食草动物侵害的作用[20]。不同品种以及不同类型腺体的内部储藏物质和生物学功能都不尽相同，因此不同类型的腺体在不同的有害环境中所发挥的作用是有很大差异的[4]。例如木本植物米团花的腺毛中能够合成和储存二倍半萜化合物，对植食性昆虫具有较强的拒食活性[21]；番茄的腺毛能够合成多种黄酮类和萜类物质，对鳞翅目或同翅目害虫的生长有抑制作用[22-24]。在用荧光显微镜观察试验中，通过腺毛所散发的不同的荧光颜色可初步推测其中的化学物质的不同[25]。杜鹃叶片表皮毛在荧光下的颜色呈现暗红、黄色或金黄色，不同品种叶片上的腺毛，以及不同发育阶段叶片上的腺毛呈现出不同的颜色，而且不同颜色的腺体所占总数的比例也不同，这可能也与腺体内含物的成分不同有关，因此可对其腺毛中的成分进行提取和化学分析，挖掘与抗虫相关的化合物，为进一步释清杜鹃的抗虫机制奠定基础。

杜鹃叶片表皮毛对杜鹃冠网蝽寄生活动的影响具有两面性，叶片上密集的细柔表皮毛不利于杜鹃冠网蝽在叶片上的附着与爬行；而较为粗壮的表皮毛，能为杜鹃冠网蝽的取食活动提供支撑与掩护。因而，杜鹃的抗虫性与其叶片表皮毛的密度和形态都密切相关。同时，4个杜鹃品种叶片上附着有不同密度与形态的腺毛，是否能分泌有特殊功能的化学物质从而影响杜鹃冠网蝽的寄生偏好性，还须进一步研究验证。