植物蛋白饮料掺假鉴别技术研究进展

梁美丹，肖 剑，劳嘉倩，林秀敏，陈 楷，蒋佳希

（广州市食品检验所，广东广州 511400）

植物蛋白饮料是以植物果仁、果肉及大豆为原料（如花生、杏仁、核桃仁和椰子等），经加工、调配后，再经高压杀菌和无菌包装制得的乳状饮料，其不含或含较少的胆固醇，富含蛋白质、氨基酸及适量的不饱和脂肪酸，营养成分较全面，深受消费者欢迎，已成为饮料市场上不可或缺的产品[1]。统计数据显示，2007年以来各饮料子行业增速最快的是植物蛋白饮料，2016年植物蛋白饮料行业收入为1 217.2亿元，2020年植物蛋白饮料市场高速发展，增速高达800%，购买人数上升900%，销量增速远超其他饮料品类，在饮料市场中成长贡献15.5%，排名第3。随着植物蛋白质饮料原料价格的上涨，部分生产企业为降低生产成本，在饮料中掺入廉价的植物蛋白粉，或掺入成本低廉的非产品标识的植物原料，如央视在2018年“3·15”晚会中，曝光了多家企业在生产核桃露时未使用核桃浆，而使用成本远低于核桃浆的花生酱或核桃香精代替，上述行为严重扰乱社会市场秩序，损害消费者的合法权益。目前，植物蛋白饮料市场掺杂使假情况比较严重，群众关注度高，有研究表明市场上35%蛋白质饮料标识的植物源性成分未检出，存在与产品标识成分及含量严重不符的情况[2]。因此，对于植物蛋白饮料掺假鉴别技术研究有重要的实际意义。

1 检测技术

目前，植物蛋白饮料检测的相关标准落后及不全面，采用定性检测的方法无法对植物蛋白饮料的成分进行高通量快速鉴定及品质的准确定量，监管部门不能准确、快速认定产品是否具有掺假行为，给人们的生活质量和安全带来不稳定的因素。目前，针对植物蛋白饮料中源性成分鉴伪的研究相对较少，主要集中于酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、色谱和质谱技术、电泳技术以及分子生物学技术。

1.1 ELISA检测技术

赖心田等[3]用间接竞争ELISA检测方法实现了对核桃制品中核桃含量的测定。方娟[4]建立了ELISA定量检测核桃蛋白的方法并成功组装了一款检测试剂盒。基于抗原抗体免疫原理的ELISA，由于过敏原蛋白之间存在一定程度的同源性而极易出现交叉反应，加热等加工工序会对植物蛋白饮料蛋白质及脂质的结构造成很大的影响，从而导致无法被抗体正确识别而出现假阴性，检测结果易受植物蛋白饮料工业化加工流程的影响，同时存在操作较为烦琐、检测结果不准确等缺点，不适合应用于大批量样品的检测。

1.2 色谱和质谱技术

张敬敬[5]用气相色谱法建立了核桃乳脂肪酸标准指纹图谱，对核桃乳质量进行控制，并对核桃乳进行相似度分析，建立核桃乳掺假模型，定性鉴别核桃乳掺假。张淑霞等[6]采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生源性成分，并初步建立了平行反应监测模式（Parallel Reaction Monitoring，PRM）检测核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段的方法。以蛋白质、脂质等物质为检测对象的色谱和质谱技术虽然可在一定程度上检测目标源性成分，但其检测结果易受植物蛋白饮料工业化加工流程的影响，同时存在操作较为烦琐、仪器设备昂贵等缺点。

1.3 电泳技术

王斌等[7]利用高效毛细管电泳技术获得杏仁和巴旦木特征迁移峰，以特征峰相对迁移时间结合特征峰相对强度，实现了杏仁露中巴旦木掺假的半定量分析，半定量限为10%。孙克江等[8]建立十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定核桃、杏仁、花生和大豆中的蛋白成分，通过分析不同物种的蛋白质，确定核桃、花生、黄豆和杏仁的特征条带，从而达到对食品中植物源性成分的鉴定。由于上述方法是以蛋白质为检测对象，检测结果易受到蛋白饮料深度加工的影响。

1.4 分子生物学技术

植物蛋白饮料实际生产中经常要进行一系列的高温处理，会破坏蛋白质及脂质的结构，而经过长时间高温高压的处理后，植物DNA仍能保持完整。因此，在植物蛋白饮料源性成分检测中，基因水平检测方法较蛋白及脂质检测方法更具优势。目前，应用较为广泛的分子生物学技术主要包括常规聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、环介导等温扩增技术和实时荧光PCR技术等。常规PCR技术灵敏度高、特异性好，DNA条形码技术成本低、快速可靠，均被广泛应用于食品中的定性检测。环介导等温扩增技术具有特异性强、灵敏度低、检测成本低及所需的仪器设备简单等优点，适用于致病菌、动植物源性成分等领域的定性分析。实时荧光PCR技术不仅可用于定性检测，还可测定循环阈值和初始DNA模板浓度进行相对定量。这些技术各有其优点，但却无法满足精准定量分析的需求，尤其是对于经深加工、目标检测物质丰度较低的植物蛋白饮料类终端类产品。数字PCR技术和微流控芯片技术是近年来应用于食品安全检测领域的新技术，可以弥补或解决以上技术问题。

1.4.1 微滴数字PCR

近年来，微滴数字聚合酶链反应（Dropletdigital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是继常规PCR和实时荧光PCR之后的第3代PCR技术，是基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术，可以直接计数样品中靶分子和参考DNA分子的绝对数量，不依赖于检测效率或外部校准设备。该技术具有准确性好、灵敏度高、无需任何校准物质以及可对样品核酸进行绝对定量等优势，目前已在转基因食品检测、微生物丰度检测、病毒载量的绝对定量和食品中内源性成分鉴定等方面得到较广泛的研究与应用[9-12]。ddPCR技术在植物源性食品真伪鉴别领域研究相对较少，郭楠楠等[13]建立了杏仁露中杏仁、花生源性成分ddPCR定量检测体系，并对12个市售的杏仁露进行检测发现存在着不同程度的掺假现象。目前，ddPCR技术在市场上并未形成完善的检测体系，在动植物源性成分鉴定方面的应用相对较少。

1.4.2 微流控芯片

微流控芯片技术源于20世纪90年代MANZ等[14]提出的微型全分析系统的概念，主要是指采用微机电系统技术在方寸大小的芯片上加工微米至纳米尺度的微通道网络，通过微尺度下流体的精确操控，在芯片上实现样品引入、前处理、混合、化学反应、分离和检测等功能，其系统具有微量、高效、成本低、微型化、集成化、高通量和自动化等特点。随着微流控芯片技术的发展，越来越多的检测手段能够与微流控芯片技术相结合，尤其是在生命科学领域，微流控芯片技术在核酸检测方面得到了广泛应用。以微流控环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术及微流控液滴技术为代表的微流控PCR技术在微生物分离筛查、致病菌检测、病毒检测等方面的研究是当下的研究热点之一，但在动植物成分鉴定、蛋白质饮料源性成分鉴定方面的研究较少[15-16]。微流控技术用于源性成分检测将有助于实现实际样品检测过程中的高通量操作，进一步提高与分子生物学交叉的多学科研究成果用于食品检测中的应用水平。

2 结语

鉴于目前植物蛋白饮料掺杂使假检测技术现状，急需建立植物蛋白饮料高通量定性检测特征性植物源性成分及绝对定量一体化的检测体系，实现多种蛋白质饮料目标成分高通量的快速检测，对产品标明的成分含量实现绝对定量的检测。依据现有的技术特点和检测需求，可重点考虑微滴数字PCR（ddPCR）技术、微流控芯片技术的研究应用，通过这两种技术手段构建一套成熟的特异性强、灵敏度高、绝对定量的蛋白饮料中植物源性成分高通量检测体系，为植物蛋白饮料行业中掺杂使假等问题提供有效的鉴别手段，为国家食品安全监管监测及突发事件应急提供精准的检测技术支撑。