抗冻蛋白研究进展及其在新型食品冷冻工艺中的应用

龚弋航

浙江大学生物系统工程与食品科学学院（杭州 310058）

食品冷冻是一个复杂的过程，其关键步骤是生成冰晶，冰晶是影响食品品质的重要因素[1]，其形态及分布都将影响冷冻的效率和冷冻食品的质量。在食品制冷过程中，控制冰的重结晶和水的相变是维持产品质量的2种最重要的方法[2]。传统的冷冻采用-50～ -40 ℃的冷风直吹冷冻法，水分子聚集而成的冰晶在表面膨胀，破坏食材的细胞组织，因此在解冻时会出现“渗水现象”。大的冰晶还会导致乳状液的破乳、泡沫结构的坍塌和凝胶结构的破坏。同时冷冻过程中还会产生浓缩效应，使得食品的颜色、气味和品质均出现比较大的破坏。现阶段人民对于高品质冷冻食品的物质需求，督促更多性能优良的新兴冷冻工艺出现。抗冻蛋白作为重要的生物抗冻剂应运而生，被用于食品的生产、储藏和运输的全过程以提高冷冻食品的质量。该文根据抗冻蛋白的研究进展，结合其理化特性分析其在食品冷冻中的应用和发展前景，从而为新型食品冷冻工艺的发展提供新的可能。

1 抗冻蛋白概述

1.1 来源和研究进展

抗冻蛋白（antifreeze proteins）亦称热滞蛋白，是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。最初在19世纪60年代由Devries首次从南极鱼类的血液中发现[3]，后相继在昆虫、植物体内发现有类似功能的蛋白，第一次有报道的抗冻脂蛋白从莫拉菌株中分离出，证明AFPs普遍存在于鱼类、植物、昆虫、细菌和真菌中[4]。其中植物来源的抗冻蛋白的研究起步较晚，1992年Griffith等[5]在冬黑麦的叶子中发现AFPs，被研究的植物材料达40余种。

1.2 抗冻蛋白的特性

1.2.1 热滞效应

由于冰点是固液相共存时的温度，大多数溶液冰点和熔点基本相同。而AFPs能够非依数性地降低溶液的冰点却对熔点没有影响，因此添加了抗冻蛋白的食品冰点会低于熔点，其冰点和熔点的差值称为热滞差值。AFPs的这种活性称为热滞活性[6]。

1.2.2 重结晶抑制效应

晶体溶于溶剂或熔融以后，又重新从溶液或熔体中结晶的过程中，会发生冰晶之间的聚合以及冰晶形态的改变，从而对组织造成机械损伤。而抗冻蛋白具有重结晶抑制效应，添加AFPs可抑制溶液冰晶的再结晶现象，使小冰晶均匀分布。

1.2.3 修饰冰晶的生长形态

另外，AFPs对冰晶的生长修饰具有独特作用，它可以在冰晶的表面与其结合改变冰晶的形态并抑制其生长。在低温环境下，冰晶由于受到AFPs的影响，其生长形态发生改变，由正常冰晶的扁圆型生长为六角形棱锥。随AFPs的浓度增加和作用时间的延长，冰晶的形态趋近针状[7]。

2 抗冻蛋白在冷冻中的作用机理

2.1 冷冻中冰晶的形成

水冻结是一种常见现象，冰晶形成的过程由2个过程组成：核的形成和晶粒的生长[8]。在成核过程中，水分子结合形成有序的冰粒，这有助于水分子在颗粒表面排列成冰晶。在冰晶生长阶段，通过有序添加更多的水分子来增加核粒子的大小。冰晶的形态对温度和过饱和度表现出复杂的依赖性。冰晶的冻结速率、质量扩散、导热和水分子聚集最终决定冰晶的形态多样性。冰晶的最终形态取决于溶液的溶质、温度和冰晶生长速率，并且在不同的冰晶表面上生长速率不同。冰晶在冷冻过程中还会发生变质。由于小冰晶具有较大的比表面积和较高的自由能，其尺寸将增加，形成大冰晶，即发生重结晶。重结晶包括小冰晶的融化、大冰晶的生长和冰晶的融合。重结晶的发生可能会导致细胞膜破裂、损坏并导致细胞损坏，从而使冷冻技术失去其最初的优势[2，9]。

2.2 食品系统中的冰晶

在冷冻过程中，食物系统中的化学反应和微生物的生长大大减少，有利于食物的保存。但是，冷冻过程也涉及与物理和生化反应相关的细胞结构的破坏。其中，起主导作用的因素是冰晶的形成，随之引起包括脂质氧化、内源性酶活化、蛋白质的变性和聚集等一系列问题。

根据水的纯度，冰的成核有2种形式：异质成核或均质成核。均质成核通常发生在极纯净水系统中。但是，在非纯净的水系统中更容易发生异质成核[2]。因此在食品系统中，结冰通常以异质成核的方式进行。在非均相成核过程中，水分子在悬浮的表面膜、外来颗粒或成核剂上聚集成晶体[10]。在食品系统中，产品温度下降到冰点时，原子开始形成冰核，这种冰核是平衡周围水分子的微小晶体。只要冰核的形成是稳定的，就可能在冰核的固相和液相之间添加分子促进其生长。

冷冻储存期间食物的物理变化主要表现为开裂、重结晶、水分流失和迁移；化学变化主要包括风味变差、脂质氧化、蛋白质变性以及维生素和色素的降解。其中冰晶对冷冻食品的损害主要包括机械损害、重结晶、低温浓缩和冻伤。冰晶可以通过机械应力对细胞造成机械损伤，在冷冻储存过程中对组织和细胞膜结构的破坏将导致食物质地的恶化。

2.3 抗冻蛋白的几种作用机理假说

抗冻蛋白按照来源的不同，可大致分为鱼类抗冻蛋白、植物抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白、植物抗冻蛋白和细菌抗冻蛋白。由于不同抗冻蛋白组成结构的差异，其抗冻机理也略有差别。

关于抗冻蛋白作用机理的研究大多集中在鱼类抗冻蛋白，而关于植物和昆虫蛋白作用机制不十分明确，以下是2种主要的抗冻蛋白与冰晶结合的学说。

2.3.1 吸附抑制学说

1977年Raymond等[11]提出的吸附抑制学说解释了AFPs抑制冰晶增长的机理，这也是目前接受最为广泛的抗冻蛋白作用学说。该学说认为，AFPs分子可以吸附在冰晶表面，与冰晶间的结合非常紧密，只有当冰晶融化时两者才会分离。外层的水分子不能接触到晶核，而被AFPs分子覆盖的冰晶表面停止生长。

一般晶体生长的方向与晶体的表面垂直，如果有杂质吸附在冰晶生长的通道上，那必须有一个外力促使冰在杂质上生长，使得冰晶表面的曲率变大，表面张力的增大导致体系平衡状态的改变，局部凝固点的下降导致整个体系冰点降低。因此，在“吸附抑制”学说中，抗冻蛋白的作用主要有抑制冰晶生长和降低冰点。

2.3.2 晶格匹配学说

“晶格匹配”模型由DeViles[12]在1983年提出。在“晶格匹配”模型中，冬季比目鱼AFP-Ⅰ的两亲性α螺旋通过规律排布，突出螺旋外的Thr和Asx残基，从而与冰晶棱面相结合。这一紧密的结合也使得水分子和冰晶直接难以直接接触，冰晶的进一步生长受阻。

Knight等[13]对于该学说作出补充说明，将AFPs限制冰晶整体生长的作用归结为“台阶固定”和“表面固定”，前者表现为冰晶a轴生长受阻，后者表现为蛋白尽可能铺满冰晶表面，并认为冰晶在生长中会形成新的表面，而冰晶伴随着新表面的形成会不可逆吸附更多AFPs，直到冰晶体被完全不能生长的表面包围。

除了上述2种学说外，还有“偶极子-偶极子”学说、氢原子结合模型、刚体能量学说等，分别从冰的晶体结构、微观原子角度和能量最小化的角度阐述抗冻蛋白的作用机理。

3 在食品冷冻工业中的应用

抗冻蛋白对冰晶的抑制以及改善冷冻食品的营养价值和质量的作用引起了人们的兴趣和关注，因此其在食品冷冻中具有广阔的应用前景。

3.1 基因工程技术

通过抗冻蛋白基因工程，可使原本自身不含AFPs的动植物体内产生抗冻蛋白，从而增强其抗寒能力。这一技术可用于冷冻食品原料的预处理上。运用基因工程技术将AFPs的基因转移到目标食品原料上，使之表达，从而增强其田间抗寒能力，提高采后贮藏加工特性[14]。

运用基因工程将异源高活性抗冻蛋白基因导入果蔬等食品中，可以改善速冻产品在解冻过程中常出现的汁液流汁、软烂，失去原有形态的问题，提高速冻品质量。实验表明[15]导入抗冻蛋白基因的转基因番茄可以在-6 ℃生存几个小时，且不发生形变。

在基因工程领域，目前只有鱼类AFPs基因的结构、表达调控机制有了系统研究，因此一般认为只能通过鱼类AFPs改变食品原料的抗冻性。但在赖先军等[16]研究中，将黄粉虫抗冻蛋白基因TmAFP导入植物基因表达质粒，经过农杆菌介导的遗传转化得到抗冻甘薯，证实转昆虫抗冻蛋白基因可增强甘薯抗冻能力。由此可见抗冻蛋白转基因工程的基因来源在未来的研究中有望进一步扩大，不同物种适合何种来源的抗冻蛋白基因也是值得深入研究的方向。

3.2 冷冻添加剂

AFPs可以通过直接混合、浸泡、真空渗透等物理手段添加到食品中，减小冰晶形成和重结晶对冷冻食品质构的破坏，改善食品品质，延长货架期，因此一直被认为是冷冻食品的天然抗冻剂。以下是一些常见的应用实例。

3.2.1 在冷冻乳制品中的应用

抗冻蛋白在食品中最成功的应用是添加到冷冻乳制品中。冰淇淋在加工和贮藏过程中易受升温或温度波动的影响，较大的冰晶尺寸和冰晶的重结晶会使冰淇淋质地粗糙，失去原有的细腻口感。实验证明在冰淇淋中加入燕麦中提取的AFPs，能够降低冷藏过程中温度波动对冰淇淋质地的影响[17]。基于对AFPs对冰淇淋的冷冻保护作用的研究，AFPs可以用作冰淇淋的天然抗冻剂，通过改善冰淇淋的耐熔融性，提高其玻璃化转变温度，以减少由冷冻和温度波动引起的变质，提高冷冻乳制品的稳定性。

3.2.2 在冷冻肉制品中的应用

研究发现将肉浸泡在AFPs溶液中冻藏后可以明显减小冰晶的大小并减少由于冷冻引起的组织损伤。抗冻蛋白以一定的方式与肉组织结合，但在肉中的扩散需要一定时间。除了物理浸泡法，还可以通过在宰杀前对牛羊注射AFPs的方式改善冷冻肉品质。在不同时间宰杀的羔羊中静脉注射从南极鳕鱼分离的AFPs，在真空包装后将肉样品在-20 ℃下保存2～16周。结果表明，在屠宰前1～24 h进行AFPs注射可以减少冰晶的大小和解冻后的渗水现象[18]。

3.2.3 在冷冻面团中的应用

面筋蛋白的理化性质和网络结构在冷冻过程中会被冰晶破坏，从而导致面团质量下降，而AFPs可用作冷冻面团的有益添加剂。抗冻蛋白对冷冻面团质地特性的影响研究表明，添加AFPs可以降低面团的结冰水含量[19]，从而使面团更加柔软和稳定，显著改善其发酵能力。此外，添加AFPs可以减弱冻融处理对水分流动性的影响，影响冷冻面团中水分分布并提高面团的保水能力[20]。

4 结语与展望

科学家已对AFPs在食品中应用的安全性和可行性进行评估，认为其本身既无毒性，其功能特性也不会产生任何显著的毒理学作用，通过抑制冰晶的生长并减少冰的重结晶，AFPs被认为是提高冷冻食品营养价值和质量的自然选择。但关于AFPs的研究大多还是停留在实验室内，真正在食品生产领域还未得到广泛应用，下面对限制其应用的主要原因进行总结：

1) 天然存在的抗冻蛋白数量有限，并且纯化活生物体中AFPs的成本非常高。正如上文所提到的，关于抗冻蛋白的提取大多还是实验室内的研究，相对来说提取规模比较小，应用的对象也存在一定的局限。如果要在食品生产中得到广泛的应用，必须找到一种成本低、效率高的大规模提取方式，以实现生产效率和效益的双收。

2) AFPs的添加不适用于标准的混合工艺，在诸如巴氏杀菌等需要加热或温度变化较大的工艺流程中，AFPs会由于变性变得不稳定。要实现抗冻蛋白在冷冻食品中的生产应用，必须要有一套完整合理、不会对其生理生化特性造成损害的工艺流程。因此，需要结合抗冻蛋白的特殊理化特性，进行工程技术和生产工艺方面的优化改进，与其相适配的新型生产技术有待出现。

3) 与大多数抗冻蛋白相似，通过基因工程制备的AFPs也面临着低表达和活性丧失的问题。目前已商业化生产的有抗冻糖蛋白和冬季比目鱼的I型抗冻蛋白，但主要还是用于研究领域。目前已知的抗冻蛋白在商业化食品中的生产应用为联合利华的Breyers品牌的轻双搅雪糕，作为食品和健康保健领域的巨头，该企业已有含ISPs的产品出售，但其通过转基因酵母菌生产的方式也令它面临着一些争议。

AFPs一直是近年来科研工作者所关心的领域，针对其在食品生产领域应用限制的原因，有以下主要方向值得进一步研究探索。

1) 基于AFPs在食品加工工艺流程中容易丧失活性的问题，可以进行新型AFPs的开发，如利用分子生物学手段进行AFPs的重组表达，并利用基因工程技术制备高活性重组抗冻蛋白。

2) 除了天然ADPs，在化学合成AFPs方面，也应当进一步研究其与食品体系中其他物质的作用，并完善相关的安全性评价。另外，通过探索AFPs的类似物和模拟物的合成工艺，有望实现抗冻蛋白替代品的生产。

3) AFPs的酶促修饰非常有前景，具有抗冻特性的产品可以通过用蛋白酶对明胶进行酶促修饰来获得。例如利用木瓜蛋白酶修饰的胶原蛋白肽具有抗冻活性。需要通过进一步的研究，增加EMAFP的水平并加快其在冷冻食品中的进一步应用。

另外，如何提高AFPs的分离产率，降低其应用的成本也是亟待解决的问题。随着对抗冻蛋白及其冻藏理论不断的深入研究及新技术的不断应用，AFPs将实现在商业化食品生产中得以广泛应用，真正实现科技造福人类的生产方式。