羊口疮病毒编码的NF-κB抑制基因研究进展

庞 峰,龙琴琴，程振涛,2

(1.贵州大学 动物科学学院 贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心,贵州 贵阳 550016)

羊口疮病毒(orf virus,ORFV)是一种线性双链DNA 病毒，属于痘病毒科，脊索动物痘病毒亚科，副痘病毒属。基因组大小约135 kb，编码 132个基因，基因组中心区域 (ORFs 009-111 ) 包含病毒复制和病毒粒子形成所必需的基因，而约占基因组20%的两端基因 (ORFs 001-008，112-134 ) 主要与病毒毒力、致病性、免疫逃避与免疫抑制以及宿主范围有关[1-3]。ORFV编码多个免疫调控基因[3-7]，其中血管内皮生长因子VEGF能增加血管的通透性，促进血管内皮细胞增殖，有利于病毒的复制和伤口结痂[8]；ORFV125是一个Bcl-2样蛋白，能够抑制紫外照射引起的细胞凋亡[9]；ORFV 干扰素抗性基因 OVIFNR 能竞争性的结合病毒dsRNA，抑制蛋白激酶PKR激活,阻止IFN通过激活PKR抑制病毒蛋白翻译[10]。

在哺乳动物中，核转录因子κB(NF-κB)家族包含5个成员，NF-κB1 p50、NF-κB2 p52、RelA/p65、c-Rel和 RelB。通常情况下，NF-κB二聚体与κB 抑制剂IκB蛋白在胞浆中结合并受到其抑制，处于非活性状态[11-13]。NF-κB可通过经典NF-κB信号通路和非经典NF-κB信号通路激活。经典NF-κB信号通路介导NF-κB1 p50、RelA/p65 和c-Rel的激活[13-15]；非经典NF-κB信号通路选择性的介导NF-κB2 p52和RelB的激活[16-19]。NF-κB参与调控先天和适应性免疫，癌症、炎症、应激反应、细胞凋亡等过程[20-24]。正痘病毒属的许多成员编码多种痘病毒蛋白抑制NF-κB信号通路的激活。比如，痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)至少编码12个NF-κB抑制蛋白，通过靶向NF-κB信号通路的不同阶段，主要通过抑制IKK复合物的激活发挥作用[20, 25-26]。然而，通过同源性比对发现副痘病毒属病毒编码的NF-κB抑制蛋白不能发挥作用，预示着副痘病毒属病毒可能编码新的NF-κB信号通路抑制蛋白。本文将对ORFV编码的多个NF-κB抑制基因进行综述，使大家对羊口疮病毒抑制NF-κB信号通路的策略和机制有更系统全面的认识。

1 NF-κB信号通路与病毒感染

经典NF-κB信号通路的激活需要激活受体、接头蛋白、IKK、IκBα和p50/p65。当细胞受体感受到外部刺激时，它们会通过接头蛋白将信号传递至IKK，导致IKK磷酸化，IκBα降解，p50/p65核转移以及NF-κB活化[27-30]。多种病毒可以通过不同方式干扰NF-κB信号通路，以逃避宿主的免疫应答[31-33]。病毒干扰NF-κB信号通路最直接方法是降低受体和接头蛋白的mRNA和蛋白水平。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP11蛋白降低RIG-1受体和MAVS接头蛋白的表达水平，抑制NF-κB的激活[34]。戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框3(ORF3)降低TLR4，TRAF6和NOD2的转录和翻译水平来阻断NF-κB信号通路[35]。此外，病毒可靶向IKK复合体抑制NF-κB信号通路。丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3竞争性结合NEMO，导致LUBAC介导的NEMO线性泛素化减少，抑制NF-κB信号通路[36]。传染性软疣病毒(MCV)MC160蛋白涉及降低IKKα的蛋白水平以及IKKα和IKKβ的磷酸化水平，以达到干扰NF-κB的目的。病毒还可以通过靶向IκBα，抑制IκBα的磷酸化和泛素化来抑制NF-κB的激活。猪流行性腹泻病毒(PEDV)NSP1通过抑制IκBα的磷酸化和IκBα的泛素化降解，阻断p65的核易位抑制NF-κB的激活[37]。病毒蛋白还可以通过结合p50和p65,抑制NF-κB二聚体入核来阻滞NF-κB的激活。疱疹病毒HSV-1 Us3蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过其激酶活性与p65相互作用，并在丝氨酸75的位点使p65过度磷酸化，从而抑制p65的核易位[38]。

在与宿主的长期斗争中，痘病毒已经进化中多种策略抑制NF-κB信号通路调控的基因表达，以实现其对宿主的感染。痘病毒编码的NF-κB抑制基因的基本特征[26]包括：病毒成员可编码多个NF-κB抑制基因。如痘苗病毒至少编码12个NF-κB抑制基因(如A52、 A46、B14、C4、N1L、K7、M2L、A49、K1L和E3L)[39-45]；与其他痘病毒免疫调控基因相比，痘病毒NF-κB抑制基因与宿主蛋白没有或只有较低的同源性；尽管抑制基因可以作用于NF-κB信号通路调控的细胞外、细胞质、细胞膜和细胞核过程，大多数的NF-κB抑制基因直接靶向于NF-κB亚单位或IKK 复合体；单个NF-κB抑制基因的缺失似乎对病毒的致病性无影响或只有较小的影响；除少数例外，单个NF-κB抑制基因的缺失不会导致病毒毒力的完全致弱；大多数NF-κB抑制基因在病毒感染后早期表达。

2 ORFV编码的NF-κB 抑制基因

除了VACV E3L基因与ORFV020基因具有同源性外，其他的痘病毒NF-κB抑制基因在副痘病毒属成员中均无同源性，因此通过同源性比对发现ORFV NF-κB抑制基因是行不通的。科学家通过构建ORFV编码基因缺失病毒，然后感染宿主细胞，分析基因缺失对NF-κB调控基因的影响，对ORFV NF-κB抑制基因进行筛选和鉴定。应用该方法，已有多个ORFV NF-κB抑制基因被鉴定。

2.1 ORFV024ORFV024是第1个被发现的ORFV NF-κB抑制基因[46]。它是ORFV早期转录基因，与其他病毒蛋白和细胞蛋白无同源性。通过同源重组方法构建OV-IA82△024缺失病毒，然后将OV-IA82△024和OV-IA82感染原代羊胚胎鼻甲骨细胞(OFTU)，后续进行转录组测序，发现OV-IA82△024导致NF-κB调控的细胞因子和促炎症基因(CCL20、CXCL1、CXCL2、IL-6、IL-8、NFKBIA和PTGS2)表达显著性上调。OV-IA82△024感染相较于亲本病毒OV-IA82显著激活NF-κB启动子，同时ORFV024过表达显著抑制TNF-α诱导的NF-κB-p65的磷酸化和入核。进一步试验证明ORFV024显著抑制了IkBα磷酸化以及IKKα和IKKβ的磷酸化。总的来说，ORFV024通过抑制IKKα/β复合体的磷酸化来抑制IkBα的磷酸化和降解，从而抑制NF-κB-p65复合体的磷酸化和核易位，最终达到抑制NF-κB信号通路的目的。OV-IA82△024感染并不会引起自然宿主明显的临床症状减轻，所以ORFV024不是ORFV的毒力基因。

2.2 ORFV002ORFV002是一个早晚期痘病毒基因，为ORFV复制非必需基因，不影响ORFV复制。在ORFV感染过程中，ORFV002蛋白定位在细胞核。OV-IA82△002缺失病毒感染OFTu细胞导致NF-κB调控基因(IL-1a、IL-6、IL-8、NFBIA、CCL20、CXCL3、IRF-1、ICAM-1和PTGS2)表达水平上调[47]。ORFV002显著抑制LPS或者TNF-α诱导的NF-κB信号通路的激活。ORFV002不能抑制TNF-α诱导的NF-κB-p65的磷酸化和核易位，但ORFV002的表达导致NF-κB-p65乙酰化水平下降。NF-κB-p65的乙酰化依赖于p300与NF-κB-p65的结合，ORFV002通过干扰p300与NF-κB-p65的结合，降低NF-κB-p65的乙酰化水平，达到抑制NF-κB信号通路的目的。IA82△002感染并不会引起自然宿主明显的临床症状减轻，所以ORFV002不是ORFV的毒力基因。

2.3 ORFV121ORFV121是ORFV的早晚期转录基因，编码300～306个氨基酸，预测蛋白大小为36 kDa，蛋白在细胞质内呈点状分布。IA82△121病毒生长曲线证明缺失ORFV121基因不会影响ORFV在细胞内的复制。同样的，IA82△121病毒感染OFTu细胞引起NF-κB调控基因(IL-1a、IL-6、IL-8、NFBIA、CCL20、CXCL3、IRF-1、ICAM-1和PTGS2)表达水平显著上调[48]。NF-κB启动子双萤光素酶报告基因试验进一步表明ORFV121抑制NF-κB启动子活性。过表达ORFV121显著抑制了LPS和TNF-α诱导的NF-κB调控基因的转录水平。ORFV121抑制TNF-α诱导的NF-κB-p65的磷酸化和入核，但并未影响上游IkBα的磷酸化水平。总的来说，ORFV121通过与NF-κB-p65结合来抑制NF-κB-p65的磷酸化和入核，从而抑制NF-κB信号通路。动物攻毒试验证明IA82△121感染引起自然宿主明显的临床症状减轻，所以ORFV121是ORFV的毒力基因。

2.4 ORFV073ORFV073为ORFV晚期表达基因，在不同ORFV中高度保守。ORFV073编码一个大小约为21.9 kDa的病毒粒子蛋白，其主要定位在感染细胞的细胞核。OV-IA82△073缺失病毒一步生长曲线表明，ORFV073是ORFV复制非必需基因。OV-IA82△073感染OFTu细胞后显著促进NF-κB调控基因MMP13、MMP1、CASP4和IL-6的上调表达。在感染早期，OV-IA82△073会导致细胞NEMO水平升高以及IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化[49]。在非感染细胞中，单独的ORFV073足以抑制TNF-α诱导的NF-κB-p65的核易位。同样，在非感染细胞中，ORFV073抑制IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化。免疫共沉淀试验证明ORFV073不能与NF-κB上游调控因子RIPK1和 TRAF6结合，而能与NEMO结合，干扰IKK复合体的组装和激活，进而影响NF-κB信号通路的激活。羔羊攻毒试验证明ORFV073是ORFV的毒力基因。

2.5 ORFV119ORFV119是ORFV早期表达基因，编码170～206个氨基酸，预测的蛋白相对分子质量大小为18.6～22.2 kDa。ORFV119的C端有一个保守的LxCxE基序(x代表任何氨基酸)。OV-IA82 (MOI=10) 感染OFTu细胞12 和16 h，ORFV119主要在细胞质呈点状分布表达，但在感染24 h,发现有大量的ORFV119蛋白定位在细胞核。免疫共沉淀试验证明ORFV119与视网膜母细胞瘤蛋白pRb以LxCxE依赖的的方式互作。转录组测序数据表明OV-IA82△119缺失病毒感染OFTu细胞后导致NF-κB调控基因TNFα、TLR2、NF-κB1和IL36α表达上调[26]。OV-IA82△119感染导致NF-κB-p65由细胞质大量转移到细胞核。进一步试验表明OV-IA82△119病毒感染早期，显著上调IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化水平。在未感染细胞中，单独的ORFV119足够抑制TNFα诱导的NF-κB信号通路的激活。在OFTu细胞敲减pRb或者突变ORFV 119的LxCxE基序，会缓解ORFV119对NF-κB信号通路的抑制作用。说明pRb通过与ORFV119结合，抑制NF-κB信号通路。为了筛选ORFV119与TNFα诱导的NF-κB信号通路成分的潜在相互作用，研究人员开展了TRAF2,TAK1,RIP1,TRAF6 和NEMO与ORFV119的免疫共沉淀实验。结果表明ORFV119只能与TRAF2相结合，且pRb促进ORFV119与TRAF2相互作用。羔羊攻毒实验表明ORFV119是ORFV的毒力基因。ORFV119是第1个通过与pRb相互作用干扰NF-κB信号通路的痘病毒蛋白。

2.6 ORFV编码的锚蛋白大多数脊索动物痘病毒都可编码锚蛋白，ORFV作为痘病毒科副痘病毒属的主要成员，共编码5种锚蛋白：ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128和ORFV129。除痘病毒外，其他病毒几乎不编码锚蛋白[50-51]。作为痘病毒蛋白中最大的一个家族，锚蛋白不仅含有多拷贝的ANK基序，同时还具有一个与细胞F-box结构域同源的保守C端结构域。痘病毒锚蛋白的ANK重复基序主要对痘病毒宿主范围产生影响，F-box结构域则负责介导痘病毒与细胞SCF泛素连接酶产生相互作用。大多数的锚蛋白可通过与宿主细胞Skp1、Cu11相互作用，抑制NF-κB信号通路[50,52-53]。如鼠痘病毒编码的4个锚蛋白EVM002、EVM005、EVM154和EVM165均可借助其F-fox结构域靶向结合SCF连接酶，抑制IκBα的降解从而阻止NF-κB-p65核易位[54]。但ORFV锚蛋白是否类似于其他痘病毒，可通过与SCF结合抑制宿主细胞NF-κB信号通路呢？国内的王晓霞以及景志忠团队将锚蛋白连接到真核表达载体pCMV-tag2B构建锚蛋白表达质粒，然后利用双荧光素酶报告基因检测系统分析转染不同锚蛋白重组质粒对NF-κB相对荧光素酶活性的影响[50-51]。结果表明，5个锚蛋白均可抑制NF-κB信号通路。ORFV123对NF-κB信号通路的抑制作用最为明显,ORFV008和ORFV128 次之。ORFV008和ORFV123是ORFV早期表达基因且定位于细胞浆中，二者皆可通过抑制磷酸化的IκBα的降解抑制 NF-κB-p65入核，进而抑制NF-κB信号通路的活化。ORVF128表达于病毒感染细胞的早期且定位于细胞核，也是通过抑制磷酸化的IκBα的降解抑制NF-κB-p65入核，进而抑制NF-κB信号通路活化。

3 小结与展望

在与宿主的长期斗争中，ORVF编码多种蛋白抑制NF-κB信号通路，从而实现免疫逃逸。ORFV024通过抑制IKK复合体的磷酸化来抑制IkBα的磷酸化，进而抑制NF-κB-p65 磷酸化和核易位，最终达到抑制NF-κB信号通路的目的；ORFV002通过干扰p300与NF-κB-p65的结合，降低NF-κB-p65的乙酰化水平，从而抑制NF-κB信号通路；ORFV121结合NF-κB-p65抑制NF-κB-p65的磷酸化和入核，从而抑制NF-κB信号通路；ORFV073通过与NEMO结合，干扰IKK复合体的组装和激活，抑制IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化以及NF-κB-p65的核易位，从而抑制NF-κB信号通路的激活；ORFV119通过与pRb相互作用干扰NF-κB信号通路。

目前国内有关ORFV锚蛋白与NF-κB信号通路互作的研究还停留在蛋白水平,通过构建锚蛋白缺失病毒，在病毒水平研究它们对NF-κB信号通路的调控作用将更具有说服力和可信性。ORFV是否还编码其他NF-κB抑制基因,后续可通过构建ORFV基因缺失病毒，然后感染宿主细胞，分析该基因对NF-κB调控基因表达水平的影响，对潜在的NF-κB抑制基因进行筛选和鉴定。