包被丁酸钠对蛋鸡生产性能和肠道健康的影响

张 琦 张克英 白世平 王建萍 曾秋凤 彭焕伟 玄 玥 张 博 丁雪梅*

(1.四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，成都 611130；2.安迪苏生命科学制品(上海)有限公司，上海 201204)

肠道健康是影响家禽生产性能和经济效益的主要因素之一，也是可持续健康养殖的基础。肠道作为动物抵抗外来异源物的首道屏障，在维持机体内环境上发挥着重要作用。当前，随着“禁抗令”的颁布，绿色添加剂再次成为新宠，而在家禽饲粮使用的添加剂中，丁酸钠是近年来的热点。丁酸钠是一种无污染、无有害残留的饲料添加剂，其中丁酸是一种短链脂肪酸，也是丁酸钠的有效成分。研究发现，短链脂肪酸及其盐可以防止或限制禽类胃肠道中有害微生物和真菌的生长，从而有助于改善胃肠道pH，提高消化酶活性[1-2]。在动物生产中添加丁酸盐及其衍生物，有利于胃肠道的生长发育，包括细胞增殖，从而促进动物肠道健康[3]。丁酸钠原粉具有刺激性奶酪酸败性气味，在无保护情况下，自由形态的丁酸盐在家禽消化道通过细胞膜被吸收。因此，目前丁酸钠原粉在家禽上的应用受到了极大制约，而受保护的丁酸盐可以到达消化系统后部，从而增强其作用效果[4-5]。包被丁酸钠(coated sodium butyrate，CSB)通过智能微囊包被技术，对不同纯度的丁酸钠进行二次包被，克服了普通丁酸钠的缺陷，确保丁酸钠充分发挥作用[4]。目前，国内有关丁酸钠对蛋鸡的研究报道较少，特别是CSB。因此本试验研究CSB对蛋鸡生产性能以及胃肠道内容物pH、消化酶活性、通透性、炎性因子和屏障相关基因表达的影响，为CSB在蛋鸡生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的CSB(棕榈脂包被)纯度为30%，由上海某生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计及饲粮

本试验采用单因素试验设计，将预试验产蛋率无显著差异(P>0.05)的800只健康的罗曼粉蛋鸡(51周龄)分为4个组，每组10个重复，连续2笼为1个重复，每笼10只鸡。对照组饲喂基础饲粮，3个试验组分别饲喂在基础饲粮中添加300、500和800 mg/kg CSB的饲粮。试验期12周，整个试验阶段蛋鸡自由饮水和采食，设置16 h光照和8 h黑暗，每天08:30和15:00分别饲喂蛋鸡，每日10：00进行人工捡蛋，定期打扫圈舍卫生，常规接种。试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，根据NRC(1994)和我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制粉状饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

续表1项目Items含量Content玉米蛋白粉Cornproteinmeal(55%CP)3.60颗粒石粉Grainylimestone6.20粉状石粉Powderylimestone3.10磷酸氢钙CaHPO41.56L-赖氨酸硫酸盐L-Lys·H2SO4(70%)0.08DL-蛋氨酸DL-Met(99%)0.08统糠Unitebran1.46氯化钠NaCl0.30氯化胆碱Cholinechloride(60%)0.10维生素预混料Vitaminpremix1)0.50矿物质预混料Mineralpremix1)0.15合计Total100.00营养水平Nutrientlevels2)代谢能ME/(MJ/kg)11.21粗蛋白质CP15.38钙Ca4.00总磷TP0.57有效磷AP0.37可消化赖氨酸DLys0.73可消化蛋氨酸DMet0.34可消化苏氨酸DThr0.58可消化色氨酸DTry0.16可消化蛋氨酸+可消化半胱氨酸DMet+DCys0.58

1.3 样品采集

于蛋鸡62周龄末，从每个重复中选取1只健康的蛋鸡进行采血(颈静脉，3 mL)室温静置后离心(4 ℃，3 000 r/min，10 min)，分装上清液，-20 ℃保存，用于血清D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的测定。采集带有内容物的肌胃、十二指肠、空肠和回肠用于测定pH。肠道黏膜：取空肠和回肠道中后段，用提前灭菌好的剪刀将其剖开，生理盐水洗掉食糜，滤纸吸干水分后，用载玻片小心刮取黏膜于灭菌冻存管中，放入液氮，采样结束后置于-80 ℃保存，用于测定肠道相关基因的表达。无菌取十二指肠和空肠内容物于冻存管，放入液氮，之后于-80 ℃保存，用于肠道消化酶活性的测定。

1.4 指标测定

1.4.1 生产性能

试验期间，每天根据重复来记录试验蛋鸡的总产蛋数、鸡蛋总重、合格蛋数[除去沙克蛋、软蛋、破蛋、畸形蛋、脏蛋、大蛋(>75 g)、小蛋(<40 g)]及合格蛋重，每周结束后，将剩余料进行称重，以加料量和剩余量相减的差值为采食量，料蛋比、产蛋率、平均蛋重及合格蛋率等参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2004)计算。计算公式如下：

产蛋率(%)=100×(产蛋数/鸡只数)；合格蛋率(%)=100×(合格蛋数/总产蛋数)；平均蛋重(g)=总蛋重/产蛋数；料蛋比=采食量/总蛋重；平均日采食量(g/只)=耗料量(g)/实际饲养日蛋鸡只数的累加只数。

1.4.2 胃肠道内容物pH

将带有内容物的肌胃、十二指肠、空肠和回肠中部剪开一个口，将pH计(德图205型)的电极玻璃珠放到食糜表面，测定内容物pH。

1.4.3 肠道消化酶活性

取十二指肠、空肠食糜0.2 g左右，加入冰冷的生理盐水(生理盐水体积∶食糜重量=9∶1)，匀浆制成10%的组织匀浆，离心取上清液。采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。

1.4.4 血清D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的测定

取血清样本(10 μL)，依次加入样本稀释液(40 μL)和辣根过氧化物酶标记的检测抗体(100 μL)，封板膜封住反应孔，恒温箱温育(37 ℃，1 h)，弃去液体，纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，反复洗板5次。各加入底物A和底物B(各50 μL)，避光孵育(37 ℃，15 min)，加入终止液(50 μL)，酶标仪上测定样本吸光度(OD)值(波长450 nm)。酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。

1.4.5 肠道黏膜相关基因表达

1.4.5.1 总RNA的提取

称取约50 mg样品，加入1 mL Trizol试剂(TaKaRa，中国)，充分混匀裂解；然后加入0.2 mL氯仿振荡混匀，室温静置5 min后12 000×g离心(4 ℃，15 min)；随后转移上清液于新的无菌离心管中，加入0.5 mL异丙醇混匀，室温静置10 min后12 000×g离心(4 ℃，10 min)，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇[焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制]洗涤沉淀；然后10 000×g离心(4 ℃，5 min)，弃上清液，室温干燥3～5 min后，加入100 μL无酶水充分溶解RNA。

1.4.5.2 RNA检测

利用核酸蛋白仪对RNA的浓度进行测定，依据在260和280 nm处所得的OD比值来检测提取的总RNA浓度和纯度，根据比值用DEPC水将RNA浓度稀释到同一水平。

1.4.5.3 反转录

按照Prime ScriptTMRT说明书进行反转录，cDNA是反转录产物。

1.4.5.4 引物设计

引物序列由生工生物工程(成都)有限公司合成，详细序列见表2。

1.4.5.5 实时荧光定量PCR

使用ABI-7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,美国)和SYBR Green PCR Mix(TaKaRa,中国)进行实时荧光定量PCR反应。PCR反应体系为10 μL，包括5 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、上下游引物各1 μL、2 μL ddH2O和1 μL cDNA。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt计算，目的基因包括封闭蛋白-1(claudin-1，CLDN1)、闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)、黏蛋白2(mucin 2，MUC2)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.5 数据统计分析

试验数据先经Excel 2019进行初步整理，然后采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著时采用Turkey氏法进行多重比较，用回归曲线进行线性和二次趋势分析，试验结果用平均值和均值标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 CBS对蛋鸡生产性能的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加不同水平CSB对蛋鸡平均蛋重无显著影响(P>0.05)；蛋鸡第5～8周、第9～12周和第1～12周的产蛋率与饲粮中CSB添加水平呈显著线性关系(P<0.05)；与对照组相比，饲粮中添加800 mg/kg CSB可显著降低蛋鸡第9～12周和第1～12周的料蛋比(P<0.05)；饲粮中添加不同水平CSB可线性提高蛋鸡第5～8周的平均日采食量(P<0.05)；与300 mg/kg CSB添加组相比，饲粮中添加500和800 mg/kg CSB可显著提高蛋鸡第1～4周和第5～8周的合格蛋率(P<0.05)。

2.2 CSB对蛋鸡胃肠道内容物pH的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加不同水平CSB对蛋鸡肌胃pH无显著影响(P>0.05)；蛋鸡十二指肠和空肠pH与饲粮中CSB添加水平呈显著线性关系(P<0.05)；与对照组相比，饲粮中添加800 mg/kg CSB可显著降低蛋鸡回肠pH(P<0.05)。

2.3 CSB对蛋鸡肠道消化酶活性的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加不同水平CSB对蛋鸡十二指肠和空肠脂肪酶活性无显著影响(P>0.05)；蛋鸡十二指肠胰蛋白酶和淀粉酶活性与饲粮中CSB添加水平呈显著线性关系(P<0.05)；与对照组相比，饲粮中添加不同水平CSB对蛋鸡空肠胰蛋白酶和淀粉酶活性无显著影响(P>0.05)。

2.4 CSB对蛋鸡肠道通透性的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加500和800 mg/kg CSB可显著降低蛋鸡血清D-乳酸含量(P<0.05)，饲粮中添加不同水平CSB对蛋鸡血清二胺氧化酶活性无显著影响(P>0.05)。

表3 CSB对蛋鸡生产性能的影响Table 3 Effects of CSB on performance of laying hens

表4 CSB对蛋鸡胃肠道内容物pH的影响Table 4 Effects of CSB on pH in gastrointestinal contents of laying hens

表5 CSB对蛋鸡肠道消化酶活性的影响Table 5 Effects of CSB on intestinal digestive enzyme activities of laying hens U/mg prot

表6 CSB对蛋鸡肠道通透性的影响Table 6 Effects of CSB on intestinal permeability of laying hens

2.5 CSB对蛋鸡肠道黏膜相关基因表达的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮中添加不同水平CSB均可显著降低蛋鸡空肠黏膜IL-1βmRNA相对表达量(P<0.05)，显著提高空肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量(P<0.05)；蛋鸡回肠黏膜IL-1βmRNA相对表达量与饲粮中CSB添加水平呈显著线性关系(P<0.05)；各组间蛋鸡空肠黏膜IL-6和IFN-γmRNA相对表达量以及回肠黏膜IL-6、IFN-γ和IL-10 mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

表7 CSB对蛋鸡肠道黏膜炎性因子mRNA相对表达量的影响Table 7 Effects of CSB on mRNA relative expression levels of inflammatory factors in intestinal mucosa of laying hens

由表8可知，与对照组相比，饲粮中添加300和500 mg/kg CSB可显著提高蛋鸡空肠黏膜MUC2 mRNA相对表达量(P<0.05)；蛋鸡空肠和回肠黏膜ZO-1 mRNA相对表达量以及回肠黏膜MUC2 mRNA相对表达量与饲粮中CSB添加水平呈显著线性关系(P<0.05)；各组间蛋鸡空肠和回肠黏膜CLDN1 mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

表8 CSB对蛋鸡肠道黏膜屏障相关基因mRNA相对表达量的影响Table 8 Effects of CSB on mRNA relative expression levels of intestinal mucosal barrier related genes in laying hens

3 讨 论

3.1 CSB对蛋鸡生产性能的影响

生产性能是直接反映家禽营养状况和健康程度的指标之一。CSB作为一种新型的绿色添加剂，可以提高饲料的转化效率和畜禽的生产性能，因此受到越来越多的关注。赵民等[6]研究发现，CSB可以提高种母鸡产蛋率和合格蛋率，但对平均日采食量没有显著影响。张硕[7]研究发现，饲粮中添加CSB降低了仙居蛋鸡的料蛋比以及第31～60天和第61～90天的合格蛋率，还可以降低蛋鸡第1～30天和第31～60天的平均日采食量。邢文杰[8]研究发现，饲粮中添加CSB能够显著提高乌骨种母鸡37～44周龄的平均日采食量和合格蛋率。本试验结果发现，饲粮中添加CSB可在一定程度上提高蛋鸡产蛋率、合格蛋率和平均日采食量，并显著降低蛋鸡的料蛋比，这与前人的研究结果不尽相同。这可能与CSB的包被工艺有关，不同的包被工艺会影响丁酸的释放；还有可能与试验的饲养环境、CSB纯度、饲粮组成和CSB的使用剂量等因素有关。

3.2 CSB对蛋鸡胃肠道内容物pH的影响

胃肠道是动物进行消化、吸收的主要场所，动物体内消化环境受pH影响。有益菌群的增殖、病原微生物的抑制和营养物质的消化吸收都需要适度的酸性胃肠道环境，它们共同发挥着提高动物生长性能和饲料利用率、增强机体抗病能力的作用[9]。研究表明，饲粮中添加丁酸、丁酸钠或CSB对蛋鸡肌胃和小肠pH无显著影响[10-11]。Elnesr等[12]研究发现，家禽饲粮中添加0.6%的丁酸钠能降低胃肠道pH。郭传珍等[13]研究发现，丁酸钠在适宜剂量时，肉鸡消化道的pH有一定程度的降低。本试验结果发现，饲粮中添加800 mg/kg CSB显著降低了蛋鸡回肠pH，饲粮中添加CSB对蛋鸡肌胃、十二指肠和空肠pH无显著影响，但数值上与对照组相比均降低。这可能是因为CSB到达肠道后逐渐分解产生丁酸，然后进一步解离成丁酸根离子和氢离子，从而降低了肠道pH。通过包被技术处理的CSB，使得丁酸缓慢释放，并到达小肠后端发挥作用，这也是本试验结果没有发现CSB的添加会对蛋鸡肌胃pH产生影响的原因。

3.3 CSB对蛋鸡肠道消化酶活性的影响

消化酶活性的高低影响着畜禽对营养物质的消化吸收能力。消化酶活性降低，表明机体吸收功能受阻，会造成营养物质浪费，饲养成本增加。消化酶活性一般采用十二指肠和空肠食糜酶的活性来反映，这是因为大部分酶活性物质分布在小肠的十二指肠或空肠部分[14]。杨在宾等[15]研究发现，饲粮中添加丁酸钠或微囊丁酸钠，肉仔鸡肠道内各种消化酶(淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶)活性均提高。鞠婷婷等[16]研究发现，饲粮添加500 mg/kg丁酸钠和添加不同水平的CSB均能显著提高肉鸡十二指肠和空肠的消化酶活性，从而提高饲粮利用率。与上述研究结果不尽相同，在本试验中，饲粮中添加CSB可以提高蛋鸡十二指肠胰蛋白酶和淀粉酶活性，脂肪酶活性也有提高，但均无显著差异。我们分析其可能原因是，CSB的添加会使肠道pH降低，从而激活蛋白酶原，并提高胰蛋白酶活性[17]；但影响消化酶活性的因素众多，比如环境因素(温度、湿度和酸碱度)会导致部分酶失活，丁酸钠的处理工艺与其包被材料的不同也会影响CSB的作用。到目前为止，尚无关于丁酸钠或CSB对蛋鸡肠道食糜消化酶活性的影响，其原因还有待进一步研究。

3.4 CSB对蛋鸡肠道通透性的影响

肠道通透性会受到外来抗原、肠道微生物等影响，而肠道通透性又会影响动物的消化机能。二胺氧化酶是动物肠道细菌发酵的代谢终产物，由肠上皮细胞分泌，血清中D-乳酸含量和二胺氧化酶活性通常被用来反映肠道损伤或修复的程度及通透性变化情况[18-20]。动物肠黏膜屏障受损时，肠道通透性增大，血浆中D-乳酸含量提高，血浆中二胺氧化酶活性提高[21]。Dengler等[22]研究表明，丁酸盐能够在一定程度上改善动物肠道黏膜屏障功能。Zou等[23]研究发现，肉鸡饲粮中添加300 mg/kg丁酸钠可缓解葡聚糖硫酸钠引起的血清D-乳酸含量升高。王可鑫等[20]研究发现，饲粮中添加200和300 mg/kg的CSB可显著缓解注射脂多糖后断奶羔羊血清D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的升高。本试验结果发现，饲粮中添加500和800 mg/kg CSB能显著降低蛋鸡血清D-乳酸含量。这可能是CSB能与细胞表面G蛋白偶联受体结合，从而激活调控免疫反应的信号转导途径，最终维护肠道屏障功能[24]；还有可能是因为丁酸为肠黏膜提供了能量，促进了肠黏膜上皮细胞的分化、增殖，使肠黏膜细胞的结构维持正常，保持了细胞间的紧密连接，从而使得肠道通透性得到改善。

3.5 CSB对蛋鸡肠道黏膜炎性因子和黏膜屏障相关基因表达的影响

肠道炎症会对动物肠道通透性和上皮细胞功能完整性产生负面影响，所以肠道炎症能直接反映肠道的健康程度。肠道黏膜屏障功能的受损、肠道炎症的发生与IL-1β、IL-6和IFN-γ等细胞因子有关。IL-10主要是通过抑制辅助性T细胞(Th细胞)的活化及抑制IL-1β和IL-6 mRNA的表达来发挥免疫作用[25]。罗丹等[26]研究发现，饲粮中添加CSB可降低肉鸡空肠黏膜IL-1β和回肠黏膜IL-1β、IFN-γmRNA相对表达量。Wang等[27]研究发现，丁酸钠可显著降低断奶仔猪空肠黏膜中IL-6 mRNA相对表达量，但对空肠黏膜中IFN-γmRNA相对表达量无显著影响。Huang等[28]报道，饲粮中添加CSB对断奶仔猪肠道黏膜中IL-1β和IFN-γ含量无显著影响。Chen等[29]研究发现，给生长猪注射丁酸钠可显著降低回肠中IL-6 mRNA相对表达量。本试验中，饲粮中添加CSB下调了蛋鸡空肠黏膜IL-1βmRNA相对表达量，上调了空肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量，与前人研究结果相似。其可能是因为丁酸作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，使得CSB在肠道解离为丁酸后，通过诱导调节性T细胞的分化来促进IL-10的生成从而发挥抗炎作用[30]。

跨膜蛋白[闭合蛋白(occludin)、封闭蛋白(claudin)]和ZO-1组成的紧密连接在调节肠道通透性方面发挥着重要作用[31]，这些细胞间的连接保证了肠上皮结构的完整和正常功能[32]。分泌型黏蛋白MUC2是肠上皮细胞分泌的一种高分子量糖蛋白，肠道黏膜屏障受损会导致MUC2表达量下调。De等[33]研究发现，丁酸可以通过增强结肠黏膜的屏障功能来维持肠黏膜的完整性。Peng等[34]研究发现，丁酸盐通过对肠道紧密连接的促进作用，在一定程度上改善了肠道黏膜屏障功能。Yang等[35]研究发现，包被有机酸可以提高肉鸡空肠CLDN1 mRNA相对表达量。韩云胜[36]研究发现，丁酸梭菌上调了断奶仔猪结肠ZO-1基因表达。Song等[37]研究发现，丁酸钠可以上调肉鸡肠道CLDN1和MUC2的表达。Tian等[38]研究表明，饲粮中添加丁酸钠对草鱼肠道MUC2的表达有上调的作用。本试验中，蛋鸡饲粮中添加CSB可以线性提高空肠和回肠黏膜中ZO-1以及回肠黏膜中MUC2 mRNA相对表达量，这与前人研究结果基本一致。这表明CSB的添加对蛋鸡肠道屏障功能有促进作用，有利于维持肠道健康。

4 结 论

饲粮中添加CSB可以提高蛋鸡的产蛋率和合格蛋率，降低料蛋比、肠道pH和血清D-乳酸含量，提高肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性，并能够调节肠道黏膜炎性因子mRNA的表达，维持细胞间的紧密连接和增强蛋鸡肠道黏膜屏障功能。