福安地方茶树种质亲缘关系与遗传多样性

陈林海，钟吉茂，何燕燕，傅雯霏，杨 军，温铃光

1.福安市茶叶质量检测中心/福建省茶产业技术体系福安综合试验站，福建 福安 355000；2.福建省茗旗茶业有限公司，福建 福安 355000；3.福建省农业科学院 茶叶研究所，福建 福州 350012；4.福安市茶产业发展中心，福建 福安 355000

福安大白茶原产于穆云镇高岭村，又名高岭大白茶，1985年经全国农作物品种审定委员会认定为国家白茶茶树良种，编号GS 13003—1985，具有芽期早、产量高、抗逆性强等优点[1]，在近年茶业发展中因品种性状优异得到较好的种植和推广，是福安白茶、绿茶的重要原料之一。目前在高岭村及福安白云山脉周边地区还有野生茶树品种植株，其中可能有优异的种质资源待选育。随着市场需求升级，福安白茶等茶类消费增加，如何挖掘和开发更多的传统种质资源成为一个新的工作任务。

分子标记技术是种质资源鉴定的重要手段，其中微卫星标记具有在基因组中广泛分布、共显性、多态性高、重复性好等特点[2-6]，被应用于对茶树地方种质资源的品种鉴定、遗传多样性、亲缘关系、物种进化、等位基因发掘、群体结构分析等。黄丹娟等[7]对湖北省13个优良茶树品种进行鉴定，表明基于SSR荧光标记的茶树品种MCID鉴定方法具有快速、准确、高效的特点，可用于茶树良种知识产权保护、苗期鉴定及品种区分；彭靖茹[8]对24份广西德保县和隆林县的野生古茶树与栽培种茶树种质进行聚类分析，表明广西德保县和隆林县的野生古茶树种质起源相近。姜晓辉等[9]研究结果表明，云南白莺山茶树种质资源各亚群间存在着基因交流，且分为5个亚群；刘冠群等[10]研究认为四川移栽野生大茶树具有丰富的遗传多样性，建议筛选具有当地特色的部分野生大茶树进行驯化栽培，并对其进行合理科学利用与保护。郭燕等[11]研究表明，遗传因素和地理位置不同引起贵州古茶树资源有较高的遗传多样性。本试验对来自于福安市穆云乡高岭村地方茶树种质资源进行亲缘关系与遗传多样性研究，旨在为今后福安茶树育种、杂交亲本选配等提供初步依据，为福安茶产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料采样于福建省福安市穆云乡高岭村与福建省农业科学院茶叶研究所，共73个茶树种质资源（表1），采集各资源一芽二叶鲜叶后用液氮迅速冷冻处理，保存在-70℃冰箱中备用。

表1 73份供试材料与来源Table 1 Name and origin of 73 plant materials used in this study

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用改进的CTAB法[12]提取茶树基因组DNA。采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行基因组分子量大小检测，采用NanoDrop 2000型紫外分光光度计测定茶树基因组DNA的纯度与浓度。

1.2.2 引物合成

参照文献[13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息见表2。

表2 20对SSR引物及其序列Table 2 Nucleotide sequences of the 20 primer pairs

1.2.3 PCR扩增和产物鉴定

PCR反应体系为：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL（Mg2+），dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL， 上、 下 游 primer（10 μmol·L-1） 各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL（0.5 U），模板DNA1 μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，热循环程序为：94℃预变性4 min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性 45 s，不同温度条件退火 60 s，72℃延伸 75 s，重复 35 个热循环；72℃延伸 10 min，最后4℃保存。

1.2.4 数据处理

采用ABI公司的GeneMapper 4.0软件，选择GeneScan™ 500 ROX™作为分子量标准，对每一个扩增出的条带记录大小。使用Cervus 3.0软件计算多态信息含量（PIC）、等位基因频率、期望杂合度、观测杂合度等。运用NTSYSpc 2.1中的Tree plot程序进行聚类分析。运用PopGen 3.1软件计算Shannon信息指数（I）和Nei's基因多样性指数（H）等参数。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性

共扩增出162条多态性条带，每个位点4 ～18个，其中TM345标记到18个等位基因，等位基因数最少的是TM442、TM499、TM502与TM581，仅检测到4个，平均等位基因数为8.1。多态性信息量（PIC）变化为 0.284 ～ 0.867，平均值为0.608，20对SSR引物具有较高的多态信息（PIC ＞ 0.5）。观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）的数值范围分别为0.2329（M447）～ 0.8082 （TM345）和 0.3105（TM514）～ 0.8856（TM262），均值分别为0.5656和0.6520。多样性指数的数值范围为0.6508（TM514）～ 2.3402（TM262），平均值1.4027（表3）。

表3 20对引物对73份材料DNA的扩增结果Table 3 Amplification results of the 73 DNA samples with 20 pairs of primers

2.2 亲缘关系

利用20对SSR标记计算参试材料的相似系数，并根据遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，绘制聚类树状图（图1）。根据聚类图，参试材料分为6个类群。A类群为福安地方茶树种质资源与福安大白茶，B类群内主要为福安地方茶树种质资源与福建省绿茶、乌龙茶种质资源，C类群主要为福建乌龙茶品种，D类群主要为福建绿茶品种，E类群也主要为福建省品种，F类群为福安地方茶树种质资源。福安地方茶树种质资源主要分为3个类型，第一个类型主要在A类群内，主要与福安大白茶母树亲缘关系较近，且分为4个亚群；第二个类型主要在B类群内，主要与霞浦春波绿亲缘关系比较近；第三个类型主要在E类群，且与福建省主要茶树品种资源都没有聚类在一起，遗传信息具有一定的独特性。

图1 遗传相似系数聚类图Figure 1 the dendrogram of genetic similarity

2.3 群体间遗传多样性

从表4看出，参试材料的Shannon信息指数变化范围为 0.7481 ～ 1.4027。Shannon 信息指数反映的不同类群遗传多样性的顺序为：类群A ＞ 类群 B ＞ 类群 E ＞ 类群 C ＞ 类群 D ＞ 类群F；观察杂合度和期望杂合度的变化范围分别为0.4333 ～ 0.6583 和 0.5633 ～ 0.7090。其中，类群A的Ho（观测杂合度）与He（期望杂合度）相当，属于基因型的分布就越接近于平衡状态；类群D的Ho大于He，说明存在杂合子过剩；其它类群类群D的Ho小于He，说明存在杂合子缺失现象。福安地方种质资源（类群A）属于平衡，说明正常；类群D的杂合子过剩，可能是由于类群D中的试验材料主要为来自于福云系列茶树品种。福安地方茶树种质资源Shannon信息指数与福建参照品种相当，说明福安地方茶树种质资源遗传多样性高。

表4 对比6个群体遗传多样性Table 4 Contrasting the genetic diversity of 6 groups

2.4 群体间基因流与亲缘关系

Fst常用来表示群体之间的分化程度，可以用来推断群体结构、迁移及扩张等[14-15]。6 个茶树群体两两之间的Fst值见表5。Wright建议，实际研究中，FST为0 ～ 0.05；群体间遗传分化很小，可以不考虑；FST为0.05 ～ 0.15，群体间存在中等程度的遗传分化；FST为0.15 ～ 0.25，群体间遗传分化较大；FST为0.25以上，群体间有很大的遗传分化。本试验中FST值为3个类型。第一个类型为FST小于0.5，类群A与类群B间的群体间遗传分化很小，群体A与群体B中主要为福安地方茶树种质资源；第二个类型为FST值在0.05 ～ 0.15，群体间存在中等程度的遗传分化；第三个类型为FST小于0.5，类群F与其它群体间FST值都在0.15 ～ 0.25，群体间遗传分化较大，说明类群F中的福安地方茶树种质资源与其它群体资源遗传差异较大（表5）。基因流（Nm）的变动范围为1.0673～ 5.0255，群体间基因流最大的是群体A与群体B，说明群体A与群体B基因流动程度相对较高；其次群体B与群体C间基因流较高为4.2398，且群体C内主要为福建乌龙茶品种，推测群体B的资源材料带有乌龙茶属性（表5）。

表5 不同茶树群体间的FST值与基因流值Table 5 Fst statistics and gene flow among tea populations

使用软件POPGEN按照Nei（1978）计算群体间Nei遗传相似度和遗传距离分析，结果表明（表6），6个群体中主要来自福安地方茶树种质资源的类群A与类群B间遗传相似度最大（0.8832）, 遗传距离最小（0.1242），说明这2个群体间亲缘关系最近；类群C与类群F间遗传相似度最小（0.5017）， 遗传距离最大（0.6898），说明这2个群体间亲缘关系最远。根据Nei遗传距离，采用UPGMA方法构建聚类图（图2），类群A与类群B聚类在一起，然后与类群C、类群D、类群E形成一个大分支，类群F则独立被聚成一支。

表6 群体间 Nei 遗传相似度（对角线以上）和遗传距离（ 对角线以下）Table 6 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of nine populations

图2 群体遗传相似系数聚类图Figure 2 the dendrogram of population genetic similarity

3 讨论

3.1 高岭村地方茶树种质的遗传多样性

Nei’s基因多样性指数与Shannon信息指数是衡量茶树种质资源遗传多样性的重要指标。本试验选择的参照品种为36个福建省主要栽培品种，来自福建省不同地区，具有一定代表性，遗传多样性较高。37个福安地方茶树种质资源的Nei’s基因多样性指数（0.6174）、Shannon信息指数（1.2890）与参照福建茶树品种相当。同时，与其它地区种质资源研究相比，福安37个地方茶树种质资源的Shannon 信息指数高于广西部分地区野生茶树种质资源的Shannon 信息指数（0.97）[16]、四川茶树种质资源的Shannon信息指数（0.98）[17]、广东历史名茶群体种曲江罗坑茶Shannon多样性指数（1.217）[18]，与云南千家寨不同海拔野生茶树种质资源的Shannon信息指数（1.33）[19]、云南西双版纳苦茶资源的Shannon信息指数（1.30）[20]相当，略低于黔南60份野生茶树种质资源平均 Shannon信息指数1.464[21]、安徽省太平猴魁茶产区柿大茶群体种平均Shannon信息指数1.414[22]。可见，本试验初步鉴定结果说明福安市穆云乡高岭村地方茶树种质资源群体遗传多态性高，资源多样性相对丰富，挖掘和开发野生茶树品种种质资源的前景较好。

3.2 高岭村地方茶树种质资源的亲缘关系

福安穆云乡高岭村37个地方茶树种质资源主要分为3个类型，类型1和类型2与参试对照福建审（鉴）定茶树品种与地方品种均聚类在一起，类型1中的福安穆云乡高岭村地方茶树种质资源与福安大白茶亲缘关系较近，为福安大白茶有性群体种，再次证明福安大白茶发源于福安穆云乡高岭村；类型2为福安穆云乡高岭村地方茶树种质资源与霞浦春波绿（绿茶品种）、梅占（乌龙茶品种）、福建水仙（乌龙茶品种）等福建省茶树品种亲缘关系较近，初步说明福安穆云乡高岭村地方茶树种质资源同时可以用来加工制作乌龙茶与绿茶，需要进一步鉴定；类型3（GL35、GL36、GL37）未与参试对照福建审（鉴）定茶树品种与地方品种聚类在一起，初步说明类型3中资源为福安地方原产地资源，需要进一步考察、鉴定与开发利用，在今后的试验中可以作为一个重点研究方向。

3.3 今后鉴定与研究方向

福安大白茶原产地高岭村及周边地区如白云山脉等地的野生茶树种质资源丰富，在近几年收集和鉴定工作中可能还未全覆盖，需进一步挖掘本地历史上原有的知名茶树品种，如原产于福安市晓洋镇岭路村的岭路大白茶，该茶栽培历史悠久，20世纪六十年代后开始试种，至80年代还有推广，因为产量较低等原因栽培面积较小，但该茶类发芽期早、芽梢壮、茸毛多、适应性尚强、品质尚佳等优点，适制红、绿、白茶，可从茶类品质特异性方面加强开发。此外，坦洋菜茶、孟洋菜茶、林家早茶[1]等茶种质资源的收集和鉴定研究工作还将进一步开展。