红景天苷对肾癌细胞A498侵袭、免疫炎症因子及ERK1/2和STAT3活化的影响

赵 丹 杨 祺 窦 科 薛智淞（四川省医学科学院，四川省人民医院，成都 610000）

肾癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，病因尚不明确，可能与遗传、吸烟、肥胖等因素有关［1］。肾癌患者早期一般无明显症状，临床主要采用手术切除治疗，但尚缺乏有效的辅助治疗方案来预防术后复发或转移［2］。肾癌晚期患者可表现腰痛、血尿、贫血、体重减轻等，临床主要采用以内科治疗为主的综合治疗措施，但晚期癌细胞对大多治疗药物的敏感性较低，预后较差［3］。寻找敏感的肾癌治疗药物，辅助临床治疗，降低术后复发或转移，受到了研究者们的广泛关注。红景天（Rhodiola rosea）是我国传统中药的重要组成部分，红景天苷（salidroside，SAL）是红景天的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、免疫调节、减轻化疗毒性等多种药理学作用，已广泛应用于临床心血管系统、内分泌系统、抗肿瘤等领域［4］。既往研究显示，SAL可以抑制胃癌、肺癌、肾癌等多种肿瘤细胞的增殖活性，发挥抗肿瘤作用，但其对肾癌细胞的作用尚不明确，具体作用机制尚不清楚［5-7］。因此，本研究探讨了SAL对肾癌细胞A498增殖、运动和免疫的影响，并进一步分析了其可能的作用机制，旨在为肾癌的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料倒置显微镜（CKX41-A32PH）、荧光显微镜（BX-2）均购自日本Olympus公司；A498细胞购自中国科学院上海细胞库；SAL购自中国药品生物制品鉴定所，纯度＞99%；RPMI1640培养基、胎牛血清、CCK-8检测试剂盒、Transwell小室（包被Matrigel基底膜）均购自上海经科化学科技有限公司；IL-6、IL-10和TNF-α均购自上海经科化学科技有限公司；辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG、β-actin单克隆抗体、兔抗人上皮细胞钙黏素（epithelial cadherin，E-cad）、神经钙黏素（nerve cadherin，N-cad）、波形蛋白（Vimentin）、IL-10、TNF-α、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204位点）、信号传导与转录激活子3（signal transduction and transcriptional activators 3，STAT3）、p-STAT3（Ser727位点）均购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 SAL剂量的筛选采用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI1640培养基培养A498细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，隔天换液。取对数生长期细胞以1×105个/ml接种于96孔板，培养24 h后，分别于不同浓度的SAL（终浓度分别为0、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320μmol/L）孵育48 h，进行CCK-8检测，检测570 nm波长下各孔的吸光度值，计算细胞存活率，根据SAL作用浓度增殖曲线，计算半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50），设置SAL 0μmol/L组、SAL 10μmol/L组、SAL 20μmol/L组和SAL 40μmol/L组。

1.2.2 Transwell检测A498细胞侵袭取各组与SAL孵育24 h的A498细胞，取100μl细胞以5×104个/孔加于Transwell上室（上室添加无血清的培养基，下室添加正常的培养液），培养24 h后，取出Transwell小室，采用质量分数为4%多聚甲醛的进行固定，质量分数为0.1%结晶紫的进行染色，显微镜下计数膜下室面表面细胞。

1.2.3 显微镜下观察A498细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）取各组与SAL孵育24 h的A498细胞，正常培养5 d后，倒置于显微镜下，观察各组细胞形态的变化，是否发生EMT。

1.2.4 ELISA法检测细胞上清液中免疫炎症因子水平取各组与SAL孵育24 h的A498细胞，离心（1 000 g，2 min），取上清，采用ELISA法检测细胞上清液中IL-6、IL-10和TNF-α水平，严格按试剂盒说明操作。

1.2.5 Western blot检 测E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2和STAT3蛋白表达取各组与SAL孵育24 h的A498细胞，提取各组细胞的总蛋白并进行蛋白定量，经电泳、转PVDF膜，脱脂牛奶封闭2 h，加一抗E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3（稀释比例均为1∶1 000），以β-actin（1∶500）作为内参，4℃孵育过夜，加HRP标记的IgG（1∶5 000），室温下孵育2 h，电化学发光显影，凝胶图像处理系统分析各蛋白相对内参表达量。

1.2.6 免疫荧光检测ERK1/2的细胞核转位取各组与SAL孵育24 h的A498细胞，以5×104个/孔接种于24孔培养板，每孔加入200μl固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1），于4℃冰箱固定15 min，加含0.1%Triton X-100的PBS作用5 min，用含10%正常羊血清的PBS封闭30 min，加一抗p-ERK1/2（1∶100），4℃孵育过夜，加FITC标记的二抗（1∶100），37℃孵育1 h，荧光显微镜观察计数。

1.3 统计学处理采用SPSS22.0分析实验数据，满足正态分布且方差齐的计量资料均以±s表示，采用单因素方差分析组间差异性，SNK-q检验比较组内两组间差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAL抑制A498细胞增殖CCK-8实验结果显示（图1），SAL对A498细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，IC50（23.41±2.45）μmol/L，因此设置SAL 0μmol/L组、SAL 10μmol/L组、SAL 20μmol/L组和SAL 40μmol/L组。随着SAL浓度升高，A498细胞的存活率降低（P＜0.05）。

图1 SAL抑制A498细胞增殖Fig.1 SAL inhibits proliferation of A498 cells

2.2 SAL抑制A498细胞侵袭Transwell实验结果显示（图2），随着SAL浓度升高，A498侵袭细胞数减少（P＜0.05）。

图2 SAL抑制A498细胞侵袭Fig.2 SAL inhibits A498 cell invasion

2.3 SAL抑制A498细胞EMT及相关蛋白表达显微镜观察结果显示（图3A），SAL 0μmol/L组和SAL 10μmol/L组细胞排列相对较疏松，部分细胞拉长呈梭形，SAL 20μmol/L组和SAL 40μmol/L组细胞排列相对密集，细胞核皱缩变小。Western blot检测结果显示（图3B），随着SAL浓度升高，A498细胞E-cad蛋白表达升高，N-cad和Vimentin蛋白表达降低（P＜0.05）。

图3 SAL抑制A498细胞EMT及相关蛋白表达Fig.3 SAL inhibited expression of EMT and related proteins in A498 cells

2.4 SAL抑制A498细胞免疫炎症因子表达ELISA检测结果显示（图4A），随着SAL浓度升高，A498细胞上清中IL-6和TNF-α水平下降，IL-10水平升高（P＜0.05）。Western blot检测结果显示（图4B），随着SAL浓度升高，A498细胞TNF-α蛋白表达下降，IL-10蛋白表达升高（P＜0.05）。

图4 SAL抑制A498细胞免疫炎症因子表达Fig.4 SAL inhibited expression of immune inflammatory cytokines in A498 cells

2.5 SAL抑 制A498细 胞ERK1/2和STAT3的 活化Western blot和免疫荧光结果显示（图5），随着SAL浓 度 升 高，A498细 胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表达降低（P＜0.05）。

图5 SAL抑制A498细胞ERK1/2和STAT3的活化Fig.5 SAL inhibits activation of ERK1/2 and STAT3 in A498 cells

3 讨论

肾癌早期无典型症状，初诊时往往已发展至晚期，预后较差，临床尚缺乏治疗的特效药物。中药是我国传统医学的重要组成部分，资源丰富，历史悠久，近年来有研究从传统中药中筛选出了多种具有抗癌活性的药物，并将其应用于临床，取得了一定的疗效［8］。SAL是红景天的主要活性成分，可以抑制多种肿瘤细胞的恶性生物学行为，但其具体作用机制尚不清楚［9］。本研究探讨了SAL对肾癌细胞A498增殖的影响，发现SAL对肾癌细胞A498增殖的抑制作用呈药物浓度依赖性，且随着SAL浓度升高，细胞存活率下降，提示SAL以药物浓度依赖性的方式抑制肾癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。

本研究中，SAL 20μmol/L组和SAL 40μmol/L组A498细胞排列紧密，侵袭细胞数明显低于SAL 0μmol/L组，且随着SAL浓度升高，E-cad蛋白表达升高，N-cad和Vimentin蛋白表达下降。E-cad是一种钙依赖性的上皮性标记蛋白，主要分布于上皮组织，可以介导细胞间的黏附作用，其表达降低或缺失可以使细胞间黏附力降低，促进肿瘤细胞发生EMT［10］。N-cad与E-cad的作用相反，N-cad高表达可以促进癌细胞的黏附和迁移，促进肿瘤细胞的恶性生物学行为［11］。Vimentin属于中间丝蛋白家族，主要表达于间充质细胞，是细胞骨架的组成成分，可以调节细胞的黏附功能，其表达阳性是肿瘤细胞发生EMT的标志［12］。已有研究显示，EMT是肿瘤细胞脱离原发病灶向周围或远处组织扩散的基础，在肿瘤的侵袭、迁移过程中发挥重要的作用，提示SAL可以调节肿瘤EMT相关蛋白表达，抑制肿瘤细胞的间质转换，抑制肿瘤细胞的侵袭［13］。肿瘤细胞的侵袭是癌细胞转移的基础，也是影响患者预后死亡的主要因素，提示SAL可以抑制肾癌细胞的转移，改善患者预后［14］。

本研究中，随着SAL浓度升高，细胞IL-6和TNF-α水平降低，IL-10水平升高。IL-6是一种多功能的免疫炎症因子，可以刺激B细胞活化，调节肿瘤细胞的免疫逃逸，还可以诱导多种炎症介质释放，促进肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭［15］。TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞产生，可以激活炎症信号通路，诱导IL-6表达，还可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成等，参与肿瘤的恶性进展［16］。IL-10是细胞内重要的免疫炎症抑制因子，可以抑制IL-6、TNF-α的合成和分泌［17］。既往研究显示，TNF-α还可以参与调节肿瘤细胞的ERK1/2、JAK/STAT、NF-κB等信号通路，参与调节肿瘤细胞恶性生物学行为，介导肿瘤的恶性进展［18-19］。LI等［20］研究显示，SAL具有抗炎作用，可以抑制MAPK和NF-κB信号通路，抑制TNF-α诱导的免疫炎症反应，提示SAL可以抑制免疫炎症因子IL-6和TNF-α表达，抑制肾癌细胞的恶性生物学行为。

本研究中，随着SAL浓度升高，细胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表达降低。ERK1/2是一种细胞外调节蛋白激酶，属于MAPK家族，可以将细胞外信号从表面受体传导至细胞核，调节肿瘤细胞的恶性增殖和运动［21］。STAT3属于STAT家族，可以与酪氨酸激酶（tyrosine kinas，JAK）组成JAK/STAT信号通路，参与细胞内的信号传导，调控肿瘤的炎症、增殖和侵袭［22］。STAT3是ERK1/2的底物之一，ERK1/2磷酸化和核转位可以激活STAT3，调节肿瘤细胞的免疫炎症反应，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、EMT等过程［23-24］。LV等［25］的研究显示，SAL可以抑制STAT3的表达，抑制肾癌细胞的增殖，提示SAL可能通过抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化，调控肾癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，SAL可以调节肿瘤细胞免疫炎症因子表达，抑制肾癌细胞A498的增殖、侵袭和EMT，其作用机制可能与抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化有关。但本研究仅探讨了SAL对肾癌细胞的作用及可能的机制，尚需大量的临床前研究来验证。