miR-449a靶向调控外周血Toll样受体5影响风湿性心脏病发生发展的分子机制研究①

李宝亮 苏 华 李梦嘉 耿丽娜 马俊帅（河北北方学院附属第一医院检验科，张家口 075000）

风湿性心脏病是唯一可预防的心血管疾病，最近几十年来，全球风湿性心脏病的负担有所减轻，但中低收入国家的患病率和病死率仍然很高［1］。风湿性心脏病每年影响超过3 000万人，且每年导致超过30万人死亡［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是单链内源性非编码小RNA（长度约22个核苷酸）。miRNA通常与目标信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）结合以抑制基因表达，它们涉及许多生物学过程，例如细胞分化、凋亡、增殖和侵袭［3］。先前的研究发现，miR-449a在硅胶处理的小鼠肺组织中显著下调，是自噬的重要调节剂，也是肺纤维化的新型内源性抑制剂，miR-449a通过靶向Notch-1信号通路保护H9C2细胞免受缺氧/复氧诱导的损伤，包括细胞凋亡和坏死［4］。但是，人们对miR-449a在风湿性心脏病中的表达模式和作用仍知之甚少。Toll样受体5（Toll-like receptor 5，TLR5）在风湿性心脏病进展中起重要作用［5］。血小板特异性TLR5等TLR的存在与血管炎症和/或心血管危险因素有关［6］。然而miR-449a是否通过TLR5参与风湿性心脏病的发生发展，目前仍不清楚。本研究通过功能获得实验探索miR-449a在风湿性心脏病中的作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂M199培养基、胎牛血清（美国Hyclon公司）；Lipofectamine2000试剂（美国赛默飞世尔公司）；miR-449a模拟物、模拟物阴性对照miR-NC、miR-449a抑制剂（anti-miR-449a）、抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）、TLR5小干扰RNA（si-TLR5）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、TLR5过表达载体（pcDNATLR5）、过表达空载对照（pcDNA）（上海吉玛公司）；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）（美国Sigma公司）；磷脂酰结合蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒（美国BD公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega）；TLR5抗体、细胞核相关抗原Ki-67（nuclear associated antigen Ki67，Ki-67）抗体、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗体、磷酸化p65（p-p65）抗体、磷酸化IκBα（p-IκBα）抗体（英国Abcam公司）。

1.1.2 临床组织标本本研究获得河北北方学院附属第一医院伦理委员会的批准。2016年6月至12月，在获得所有受试者或监护人的知情同意后，对河北北方学院附属第一医院心胸外科住院治疗的9例风湿性心脏病患者和接受体检的健康志愿者在内的所有参与者展开实验。所有患者在本院进行了病理学诊断，排除非风湿性心脏病、自身免疫性、感染性疾病等疾病。取风湿性心脏病患者和健康志愿者清晨空腹状态下的外周静脉血5 ml，使用柠檬酸钠抗凝后，于-70℃冰箱保存，直至RNA和蛋白提取。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染风湿性心脏病心肌细胞的分离提取根据宋智钢等［7］的报道进行。风湿性心脏病心肌细胞在含150 ml/L胎牛血清的M199培养基中培养。当风湿性心脏病心肌细胞达到70%融合时，按照miR-NC组（转染miR-NC）、miR-449a组（转染miR-449a模拟物）、si-NC组（转染si-NC）、si-TLR5组（转染si-TLR5）、anti-miR-NC组（转染antimiR-NC）、anti-miR-449a组（转染miR-449a抑制剂）、miR-449a+pcDNA-NC组（共转染miR-449a和pcDNA-NC）、miR-449a+pcDNA-TLR5组（共转染miR-449a+pcDNA-TLR5）的分组，使用Lipofectamine2000试剂进行转染，48 h后进行其他指标检测。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR根据Trizol试剂的说明，从风湿性心脏病外周血和心肌细胞中提取总RNA，并将其存储在液氮中。对于RNA定量，通过紫外分光光度计测定所有样品在260 nm和280 nm处的吸光度值之比（A260/A280）。使用逆转录试剂盒反转录为cDNA，SYBR Green PCR Master Mix在Applied Biosystems AB7500实时PCR系统上进行实时PCR扩增。miR-449a、TLR5 mRNA引物（由上海生工公司合成）序列为miR-449a F：5′-TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC-3′和R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；TLR5 F：5′-ATTCTTGCCCACCACAT-3′和R：5′-GGTTGTCAAGTCCGTAAA-3′；β肌动 蛋 白（β-actin）F：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′和R：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′；U6 F：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′和R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。β-actin和U6表达水平分别用作内源性对照，以分别标准化mRNA和miRNA的 表达，并 通过2-ΔΔCt法 定量 相 对表达。

1.2.3 细胞增殖测定为了检测风湿性心脏病心肌细胞存活率，在特定处理后进行MTT测定。将细胞接种到96孔板中，2×104个/孔。48 h后添加MTT溶液，每孔20μl，然后在37℃孵育4 h。除去上清液后，每孔加入200μl PMSO。用酶标仪测定490 nm的吸光度，以实验组和对照组吸光度值之比（A实验组/A对照组）计算细胞存活率（%）。

1.2.4 流式细胞仪分析风湿性心脏病心肌细胞经过特定处理后，收集细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后进行细胞凋亡分析。将每个样品的细胞（1×106个）重新悬浮在结合缓冲液中，并通过AnnexinV-FITC/PI试 剂盒 用AnnexinV-FITC和PI染色。实验结束时，通过流式细胞仪对凋亡细胞进行分析和定量。

1.2.5 Western blot为测定TLR5、Ki67、Cleavedcaspase-3、p-p65和p-IκBα蛋白表达，收集待测的样本或细胞，在冰上，将其于RIPA缓冲液中裂解，并在4℃下以12 000 r/min离心10 min。以牛血清白蛋白为标准品，通过喹啉酸测定蛋白浓度。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离出等量的蛋白（50μg），然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与含有0.05%Tween 20和5%脱脂乳的PBS孵育以阻断非特异性结合，接着与相应的一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗孵育。用增强的化学发光液显色显影后，使用凝胶成像系统和Image LabTM软件对条带密度进行定量分析。以β-actin为对照，分析TLR5、Ki67、Cleaved-caspase-3、p-p65和p-IκBα蛋白表达。

1.2.6 双荧光素酶报告基因分析使用Starbase靶位点预测软件选择miR-449a的潜在靶基因，包括TLR5。为探究miR-449a是否靶向TLR5，将miR-449a结合位点的TLR5-3'UTR-野生型（WT）及突变型（MUT）序列克隆到pmirGLO双荧光素酶载体中，并将该载体命名为TLR5-3'UTR-WT和TLR5-3'UTR-MUT。将风湿性心脏病心肌细胞接种到24孔板中，然后与TLR5-3'UTR-WT或TLR5-3'UTRMUT和miR-449a模拟物或其对照miR-NC共转染。按照试剂盒说明书操作，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定细胞的荧光素酶活性。

1.2.7 ELISA测定炎症因子的释放为了测定炎症因子IL-1β、TNF-α水平，收集待测的细胞上清，根据IL-1β、TNF-α试剂盒的说明，检测炎症因子IL-1β、TNF-α的释放。

1.3 统计学分析数据采用SPSS22.0软件进行统计与分析，数据以±s表示。两组间数据比较采用t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 风湿性心脏病患者外周血TLR5和miR-449a表达水平qRT-PCR和Western blot检测风湿性心脏病患者外周血中miR-449a和TLR5的表达（图1），结果发现，与健康志愿者比较，风湿性心脏病患者外周血中miR-449a的表达水平明显降低，TLR5 mRNA和TLR5蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。2.2过表达miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞存活率和凋亡率的影响在风湿性心脏病心肌细胞中转染miR-449a模拟物，qRT-PCR检测数据显示（图2A），转染miR-449a模拟物后miR-449a的表达水平远远高于转染miR-NC的细胞，说明成功过表达miR-449a。Western blot、MTT和流式细胞仪分析结果表明（图2B～D、表1），与miR-NC组比较，miR-449a组风湿性心脏病心肌细胞的Ki67蛋白表达水平明显提高，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低，细胞存活率明显增加，而凋亡率显著减少（P＜0.05）。

表1 过表达miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of overexpression of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表1 过表达miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of overexpression of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-449a t P Apoptosis rate（%）22.43±2.12 10.02±1.051）15.737 0.000

图1 风湿性心脏病患者外周血TLR5和miR-449a表达水平Fig.1 TLR5 and miR-449a expression levels in peripheral blood of patients with rheumatic heart disease

图2 过表达miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞存活率和凋亡率的影响Fig.2 Effects of overexpression of miR-449a on survival rate and apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease

2.3 低表达TLR5对风湿性心脏病心肌细胞存活率和凋亡率的影响将TLR5小干扰RNA si-TLR5转染至风湿性心脏病心肌细胞，结果发现（图3），同转染si-NC组比较，转染si-TLR5显著降低TLR5蛋白表达水平（P＜0.05），提示成功低表达TLR5。Western blot、MTT和流式细胞仪分析结果表明（图3、表2），与si-NC组比较，si-TLR5组明显提高风湿性心脏病心肌细胞的Ki67蛋白表达水平，显著降低Cleaved-caspase-3蛋白表达水平，明显增加细胞存活率，并显著降低凋亡率（P＜0.05）。

表2 低表达TLR5对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of low expression of TLR5 on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表2 低表达TLR5对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of low expression of TLR5 on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-TLR5 t P Apoptosis rate（%）23.01±2.27 12.63±1.141）12.259 0.000

图3 低表达TLR5对风湿性心脏病心肌细胞存活率和凋亡率的影响Fig.3 Effects of low expression of TLR5 on survival rate and apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease

2.4 miR-449a靶向TLR5，调控TLR5蛋白的表达Starbase预测miR-449a的靶基因（图4A），发现miR-449a与TLR5-3'UTR之间存在靶向结合位点。双荧光素酶活性检测进行验证（图4B），结果显示，与miR-NC组比较，miR-449a组转染TLR5-3'UTR-WT细胞的荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而miR-449a组转染TLR5-3'UTR-MUT的细胞荧光素酶活性差异无统计学意义。Western blot检测结果表明（图4C），miR-449a组TLR5蛋白表达水平明显低于miR-NC组；anti-miR-449a组TLR5蛋白表达水平明显高于anti-miR-NC组（P＜0.05）。

图4 miR-449a靶向TLR5调控TLR5蛋白表达Fig.4 miR-449a targets TLR5 and regulates expression of TLR5 protein

2.5 高表达TLR5可以逆转miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞存活率和凋亡率的影响在风湿性心脏病心肌细胞中共转染miR-449a模拟物和TLR5过表达质粒pcDNA-TLR5，结果显示（图5、表3），与miR-449a+pcDNA-NC组 比 较，miR-449a+pcDNATLR5组风湿性心脏病心肌细胞的TLR5蛋白表达水平明显升高，Ki67蛋白表达水平显著降低，Cleavedcaspase-3蛋白表达水平明显升高，细胞存活率明显减少，细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。

表3 高表达TLR5可逆转miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.3 Over expression of TLR5 can reverse effect of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表3 高表达TLR5可逆转miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.3 Over expression of TLR5 can reverse effect of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with miR-449a+pcDNA-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-449a+pcDNA-NC miR-449a+pcDNA-TLR5 t P Apoptosis rate（%）10.52±0.93 20.36±1.831）14.381 0.000

图5 高表达TLR5可逆转miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞存活率的影响Fig.5 Over expression of TLR5 can reverse effects of miR-449a on cardiomyocyte survival and apoptosis in rheumatic heart disease

2.6 NF-κB信号通路相关蛋白表达情况以及炎症因子的释放水平对NF-κB信号通路相关蛋白表达的检测结果表明（图6、表4），与miR-NC组比较，miR-449a组风湿性心脏病心肌细胞中p-p65和p-IκBα蛋白表达水平、IL-1β、TNF-α水平明显降低（P＜0.05）；同时高表达TLR5后，相比于miR-449a+pcDNA-NC组，miR-449a+pcDNA-TLR5组p-p65和p-IκBα蛋白的表达水平、IL-1β、TNF-α水平显著升高（P＜0.05）。

图6 Western blot检测p-p65、p-IκBα蛋白表达Fig.6 Western blot detection of p-p65，p-IκBαprotein expressions

表4 各组处理细胞炎症因子的释放水平（±s，n=9）Tab.4 Release levels of inflammatory factors in treated cells in each group（±s，n=9）

表4 各组处理细胞炎症因子的释放水平（±s，n=9）Tab.4 Release levels of inflammatory factors in treated cells in each group（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05；compared with miR-449a+pcDNA-NC，2）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-449a miR-449a+pcDNA-NC miR-449a+pcDNA-TLR5 F P IL-1β/（pg·ml-1）63.02±6.02 31.05±3.011）28.63±2.86 54.16±5.162）130.139 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）2.09±0.17 0.96±0.091）0.94±0.08 1.73±0.152）179.654 0.000

3 讨论

尽管在风湿性心脏病的发病过程中已经了解了一些miRNA的分子机制，但在其发展过程中，miR-449a表达的特定模式仍然知之甚少。因此，有必要深入研究风湿性心脏病的miR-449a功能，并开发其在风湿性心脏病恶性进展中的新调节作用。本研究探索了miR-449a作用及其潜在机制。通过功能获得实验来分析miR-449a在风湿性心脏病中的作用。结果发现miR-449a在风湿性心脏病患者外周血中的表达较低，当miR-449a高表达时，风湿性心脏病心肌细胞增殖被促进，且细胞凋亡、炎症因子的释放被抑制，机制与靶向TLR5、调控NF-κB信号通路有关，这证明了miR-449a作为风湿性心脏病生物标志和治疗靶点的巨大潜力。

首先，本研究发现miR-449a的表达在风湿性心脏病患者外周血中被下调。该结果表明miR-449a参与了风湿性心脏病。先前的研究表明，miRNA异常表达与疾病多种生物学过程有关，包括风湿性心脏病［8-9］。为了揭示miR-449a在风湿性心脏病中的作用，利用MTT和流式细胞术测试miR-449a对细胞生长的影响，发现miR-449a过表达可以促进风湿性心脏病细胞增殖并抑制细胞凋亡，降低炎症因子的释放。miR-449a位于染色体5q11，是miR-34家族成员之一，此前已被报道在几种人类疾病中显著下调，包括骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌等，表明其在肿瘤发生和发展中的抑癌作用［10-12］。除此之外，类风湿关节炎滑膜组织中检测到了miR-449a的下调，miR-449a通过靶向高迁移率族蛋白1起着抑制类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖，迁移和炎症的作用［13］。在脑缺血损伤中，miR-449a被下调，在缺血/再灌注损伤模型中，miR-449a的过表达可以恢复神经功能，保护脑缺血性损伤［14］。本研究证明，miR-449a是风湿性心脏病发病机理中的关键分子，也是miRNA替代疗法的合适候选者。

本研究表明，TLR5 mRNA和TLR5蛋白的表达在风湿性心脏病患者外周血中显著升高。根据报道，TLR5基因的遗传变异与中国汉族人群的风湿性心脏病有关，其基因多态性可能是识别易感人群风湿性心脏病高危人群的有用标志［15-16］。在心肌缺血再灌注损伤后，TLR5的缺乏促进了梗死面积的增加和心肌氧化应激，加剧急性左心室功能障碍［17］。本实验利用TLR5小干扰RNA干扰TLR5的表达，结果显示，低表达TLR5后，风湿性心脏病心肌细胞的Ki67蛋白表达水平、细胞存活率明显增加，Cleavedcaspase-3蛋白表达水平、凋亡率显著降低。miRNA通常通过直接结合mRNA的3'UTR执行生物学功能［18］。本实验主要通过使用Starbase确定TLR5是miR-449a的预测靶标。双荧光素酶活性测定表明miR-449a直接靶向TLR5。Western blot分析证实，miR-449a在风湿性心脏病心肌细胞中负调控TLR5的表达。此外，高表达TLR5后，miR-449a促进风湿性心脏病心肌细胞增殖、Ki67蛋白表达的作用，以及抑制细胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表达的作用被逆转。以上结果表明，TLR5是风湿性心脏病中miR-449a的靶标。

NF-κB信号通路的活化有助于风湿性心脏病的发生和发展，这与炎症因子IL-1β、TNF-α的释放密切相关［19-21］。TLR5沉默可通过失活NF-κB和MAPK信号来抑制肝细胞凋亡，氧化应激和炎症反应，从而减轻高氨血症所致的肝损伤［22］。TLR5激活人类牙髓细胞中的NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路，诱导促炎症介质尿激酶纤溶酶原激活物的表达［23］。miR-449a通过靶向HMGB1介导的NF-κB信号通路抑制非小细胞肺癌的肿瘤生长、迁移和侵袭［24］。本研究证明，miR-449a下调了NF-κB信号通路活性。但是在高表达TLR5后，miR-449a模拟物对风湿性心脏病心肌细胞中p-p65、p-IκBα蛋白表达和炎症因子IL-1β、TNF-α释放的影响被逆转。说明miR-449a可能通过下调TLR5抑制NF-κB途径来促进细胞增殖并减少细胞凋亡。

综上所述，本研究首次发现miR-449a在风湿性心脏病中起保护作用，可以促进风湿性心脏病心肌细胞的增殖，并抑制其凋亡和炎症因子水平，作用机制与靶向TLR5抑制NF-κB信号通路活性有关。因此，miR-449a可能成为治疗风湿性心脏病的潜在治疗靶标。