多糖结合疫苗技术评价常见药学问题浅析

杨丹，李敏

国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022

多糖结合疫苗为荚膜多糖与载体蛋白共价结合形成的复合物，其选用的载体蛋白使多糖由T 细胞非依赖性抗原转变为T 细胞依赖性抗原，增强了多糖的免疫原性，能够有效改善多糖疫苗不能在2岁以下儿童、老年人及免疫缺陷者等易感人群体内激发有效免疫应答的问题［1］。

我国已上市多糖结合疫苗有：13 价肺炎球菌多糖结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗（CRM197 载体）、b 型流感嗜血杆菌结合疫苗及包含该组分的联合疫苗。多糖结合疫苗是近年的研发热点，以肺炎多糖结合疫苗为例，2018—2021年共有2个国产13 价肺炎球菌多糖结合疫苗获批上市，6个获批临床，另外，还有20 价、24 价肺炎球菌多糖结合疫苗获批临床。2021年，FDA 批准美国默沙东公司的15 价肺炎结合疫苗和美国辉瑞公司的20 价肺炎结合疫苗用于18岁以上成年人群。随着多糖结合疫苗新工艺的研发及新分析方法的应用，研究过程中还存在一些需要讨论的问题。本文对技术评价关注的药学问题进行了梳理，以期为多糖结合疫苗研发、生产及产品质量提升提供借鉴。

1 生产工艺

多糖结合疫苗生产工艺较为复杂，可能涉及细菌发酵、多糖纯化、水解、衍生、活化、结合等多个工艺步骤和生产阶段，生产、控制和产品质量及批间一致性等方面受影响的因素较多［2］。由于多糖结合疫苗高度依赖工艺路线和工艺控制，多个质量属性可能在较大范围内波动，除参考ICH 药物研发（Q8）、质量风险管理（Q9）和药品质量系统（Q10）指导原则［3-5］，在对物料属性、工艺路线及工艺参数等进行常规筛选研究的基础上，建议工艺研发过程中开展更多研究，确证工艺参数对质量属性的影响，加强工艺控制，确保批间一致性及工艺耐用性。

工艺开发过程中，在常规放行检测基础上，建议对不同工艺步骤产物（多糖、降解产物、衍生物、结合物原液等）分子量大小、有效官能团含量进行检测，分析工艺过程是否对多糖的主要抗原结构产生显著不利影响，为工艺路线及参数的合理化提供更多依据。部分品种在项目研发过程中以理化指标、动物免疫原性等为考察指标对衍生率、结合物分子大小、游离多糖含量等关键工艺参数范围、质量属性范围进行较为充分的工艺研究及表征，以确保在拟定工艺参数范围及质量标准范围内生产产品的安全性、有效性具有可比性。

多糖结合疫苗涉及中间产物较多，应建立较全面的过程控制，其中对于中间体是否开展必要的放行检测存在不同考虑。部分研发者认为多糖降解产物不是关键中间体，较多的过程控制给质控体系带来较大负担，仅需进行过程中工艺操作参数的控制。笔者认为，考虑降解多糖分子大小与后续生产及产物免疫原性密切相关，同时参考已上市品种质控，建议在研发及上市的早期阶段至少对降解多糖分子大小进行放行检测。

另外，建议根据多糖结合疫苗产品和工艺的特点开展全面的生产工艺验证，除对相关样品进行过程控制及放行检测外，还应对各纯化步骤中工艺相关杂质、产品相关杂质去除效果及目标产物回收率进行较全面地研究，开展系统的多糖降解、活化、多糖-蛋白结合的动力学曲线研究，在制剂工艺验证中开展各型别结合物吸附率及吸附动力学曲线研究等。WHO 在肺炎多糖-蛋白结合疫苗指导原则中指出，应证明每批次化学修饰后的多糖或载体蛋白上均不含活化的功能团，或可监测封闭反应的产物或检测封闭反应以显示未发生反应功能团的去除情况［6］。因此，建议在工艺验证中进行非结合活化位点检测及去除效果的相关研究。

2 半成品配制及产品规格

《中国药典》三部（2020 版）规定，对半成品配制点的控制应选择与有效性相关的参数进行测定，半成品配制时应根据有效成分测定方法的误差、不同操作者间及同一操作者不同次操作间的误差综合确定配制点［7］。但在技术评价过程中发现多家企业多糖结合疫苗半成品配制存在预配制过程，即在预配制过程中根据检测结果进一步调整配制点，以满足最终成品质量标准要求。该操作难以确保每批产品的投料量一致，与药典要求不符，且难以确保上市产品的安全有效性。建议企业从前期研发起始就按照相关要求开展科学规范的研究，上市批次的半成品配制点、投料量均需与关键性临床批次保持一致。

已上市的多糖或多糖结合疫苗规格描述存在两种情形，大部分品种规格与配制点一致，如ACYW135多糖疫苗；个别品种与成品多糖含量标准下限一致，如b 型流感嗜血杆菌结合疫苗。规格与配制点不一致部分系历史遗留问题，近年批准的产品规格均采用了与国际规范一致的描述，即规格与配制点一致。质量标准应以配制点为目标值拟定上下限。上下限应结合多糖含量检测结果及稳定性考察数据，综合考虑方法学的变异情况后，拟定为配制点的上下浮动，品种规格应与配制点一致。

3 质量标准

国内外药典及WHO 指导原则中已对多糖结合疫苗各中间产物及成品质量控制提出基本要求，企业应根据品种自身工艺特点及稳定性考察数据进一步合理拟定质量标准，原则上应不低于国家标准及已上市的同类产品。本文对于质量标准项目的设置不做过多讨论，主要对多糖结合疫苗技术评价中常见的质量标准问题进行梳理和讨论。

3.1 分子大小检测

3.1.1 检测方法 《中国药典》三部（2020 版）中规定，ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗成品、A 群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗结合物原液等多糖分子大小分布测定采用“通则3419”方法［7］。部分品种结合物原液直接采用“通则3419”中的CL-4B 凝胶色谱柱检测分子大小分布，但多批产品检测结果及方法学验证资料显示，分配系数（partition coefficient，Kd）值基本均为0，即待测样品基本被排阻于凝胶颗粒之外，未进入凝胶内水，未得到待测样品有效分离的分布数据。目前各企业多糖结合疫苗选用载体不同，如破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）、白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）、白喉毒素的无毒变异体（crossreactive material 197，CRM197）、重组肺炎球菌溶血素（recombinant pneumolysin，rPly）等；生产工艺也存在较大差异，如多糖是否降解、不同结合工艺路线，因此，最终制备的结合物原液分子大小也不同，企业应根据产品自身特点开发可客观反映分子量大小及分布情况、利于批间一致性控制的质控方法，如Sepharose CL-2B、HPLC、HPLC-MALLS、SEC-MALLS 法等，推荐使用高效液相色谱方法，但需验证所用方法在适当的分子量范围内具有足够的分离度。另外，目前部分申报临床的品种已将SEC-MALLS、HPLC-RI 法等作为分子大小及分布放行检测方法，属于技术评价予以鼓励的方向。但为与药典标准有效衔接，建议临床试验期间同时使用以上方法与CL-4B（或CL-2B）法进行分子大小及分布检测，积累数据并分析两种方法的相关性。

3.1.2 质量标准 分子大小分布中Kd 界值选择至关重要，不同的Kd 界值对应回收率的批间一致性会存在较大差异，不适宜的Kd 值虽会呈现表观稳定的回收率，但掩盖了实际产品的批间差异。建议企业对不同Kd 界值的回收率进行统计，最终确定的Kd 界值应能较敏感地反映产品批间一致性，同时推荐对50%峰面积对应的Kd 值进行相关研究并积累数据。

3.2 多糖含量检测 多糖结合疫苗结合物原液中一般采用化学法检测多糖含量，成品中由于化学法无法对各型多糖进行区分，多采用免疫法进行多糖含量检测，如速率比浊法。化学法和免疫法的多糖含量检测结果存在系统差异，因此，导致部分品种出现成品多糖含量不能满足“配制点± 30%”的相关要求。建议企业在前期研发中对两种方法的相关性进行充分研究及数据积累，避免因检测方法导致上市申报批次与关键临床批次配制点存在差异，从而需要更多的免疫原性数据进行支持性评价。

速率比浊法检测多糖含量的原理为多糖与相对应血清群的抗体发生反应后形成抗原抗体复合物，复合物含量与散射光强度成正比［8-9］。检测用血清的制备工艺和质量控制存在差异，可能存在不同血清型间的交叉干扰，对单价原液多糖含量检测影响不大，但用于多价成品检测时会导致检测结果出现偏差。因此在产品开发过程中应关注多糖含量免疫法检测的特异性验证及其型特异血清的标定和质控，建议对检测血清进行筛选及评价；另外，需关注不同批次检测血清可能存在的批间差异，并确保血清替换时的可溯源性，该差异可能会导致成品多糖含量检测结果超标，建议尽可能在研发早期建立足够的标准血清库。

另外，部分品种采用化学法对特异性官能团含量进行检测，对不同型别多糖同时含有同一官能团的情况，应确认检测方法的准确性，必要时进行相关系数的校正，建立相应的计算方法。

3.3 游离多糖含量检测 结合多糖是免疫学上对临床保护作用具有重要意义的成分，如游离多糖的含量过高，可能使机体产生相应抗原的低免疫应答［10］，影响其临床保护效果。各企业虽采用不同方法对游离多糖和结合多糖进行分离，如脱氧胆酸钠法、高盐高醇析出法、氢氧化铝凝胶结合法等，但均采用与结合物原液多糖含量相同的检测方法进行检测。部分品种在游离多糖方法学准确度验证中，其标准品加入浓度远高于实际游离多糖浓度，建议采用与结合物原液游离多糖实际浓度相当的标准品进行准确度验证，同时应设立游离多糖试验成功的条件，如每次沉淀游离多糖的回收率要求等。

3.4 结合抗原（bound antigenicity）及结合蛋白（bound protein）含量检测 含铝佐剂的多糖结合疫苗制备过程中需考虑佐剂对结合物及载体蛋白的吸附状态的质控，因此将结合抗原及结合蛋白检测纳入产品质控。目前各产品对上述两个指标所用检测方法原理不同，部分产品以铝佐剂吸附的多糖、载体蛋白量为结合态（分离铝佐剂吸附与未吸附的组分进行检测），部分产品以多糖蛋白结合物（对待测样品进行铝佐剂解吸附处理，再检测分离游离态组分和结合态组分）为结合态，虽然上述两种结合态均为吸附率和结合率的综合体现，但考虑佐剂吸附率与免疫原性直接相关，建议在产品开发过程中开展各型别结合物吸附率的相关研究。

3.5 载体蛋白纯度检测 多糖结合疫苗是以多糖为抗原诱导免疫应答［11］，应尽可能避免载体蛋白引起的非预期的免疫原性，由于免疫机制存在差异，载体蛋白的质控要求也与其作为疫苗组分的质控存在不同。以TT 载体蛋白为例，除抗原含量相关纯度（以絮状单位表述）外，建议对单体含量进行质控。方法学验证中应关注所选用方法是否可充分分离载体蛋白单体、聚体，同时建议进行各峰归属解析等研究。

4 稳定性

为全面考察多糖结合疫苗在贮存条件下的稳定性，确保其效期制定的科学、合理，建议在稳定性考察中增加效力检测，但需采用合理的免疫剂量。由于多糖结合疫苗涉及的中间产物较多，考虑多个中间产物多步长期保存的方式不利于产品质量的可控性，建议进行各阶段中间产物累计存放最长时间制备成品批次的稳定性研究。为更好地对临床期间变更或上市后变更进行可比性研究，各中间产物除长期稳定性外均应开展加速稳定性研究。

5 小 结

保障安全性和有效性是多糖结合疫苗药学研发的核心考虑要点。现代分子技术和方法的开发应用，为多糖结合疫苗的工艺开发、结构确证和质量控制提供了越来越多的技术支持，鼓励企业在对产品充分研究的基础上对生产工艺、质量标准进行优化。本文对既往多糖结合疫苗技术评价中的药学共性问题进行了梳理，以期为同类产品的研发、申报及审评提供参考。