自噬在多种因素所致急性肺损伤中的研究进展

李秋呈，李 琪，2，3，贾盼红，李少宁，熊晓嫚，周向东，2，3

（1. 海南医学院第一附属医院呼吸内科，海南海口 570102；2. 急救与创伤研究教育部重点实验室，海南海口 571199；3. 中国医学科学院海岛急救医学创新单元 2019RU013，海南海口 571199）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由各种因素引起的以肺泡、毛细血管通透性增加为基础，导致肺泡水肿伴大量炎症细胞浸润，继而出现急性呼吸窘迫综合症的一组综合征，其病死率可高达50%［1］。ALI 病因复杂，包括感染因素（如细菌、病毒）和非感染因素（如急性胰腺炎、吸入有害气体），ALI 目前发病机制尚不明确，所以探究ALI 发病机制迫在眉睫。目前主要治疗方案包括糖皮质激素抗炎、机械通气改善氧饱和度等。自噬在动物细胞中扮演着不同的生理及病理作用［2］。研究表明调节自噬可以减轻ALI，提示自噬可能成为ALI 治疗新靶点［3］，但自噬在不同病因引起ALI 中的作用不尽相同。

1 自噬及其相关机制

自噬是细胞分解代谢过程中，通过溶酶体介导清除胞质中缺陷、受损细胞器、变性蛋白质及病原体等，有利于细胞正常功能的运行及稳态的维持，亦是机体的防御、应激调控机制［4］。自噬根据溶酶体进入途径不同分为巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬3 种类型［3］。巨自噬也称自噬，与ALI 关系最为密切。自噬主要包含5 个部分［5］：（1）自噬过程的启动（吞噬细胞膜诱导）；（2）吞噬泡形成；（3）自噬体延伸、成熟；（4）吞噬-溶酶体复合体的融合；（5）吞噬物的降解，以上过程是由自噬相关基因（ATG）调控形成自噬相关蛋白家族（ATGs）介导完成。目前在酵母遗传学中发现有超过30 种自噬相关基因，在哺乳动物中鉴定出11 个相关基因［6］。Mercer 等［7］通过分子角度对自噬的变化过程进行了详细阐释。与自噬调控过程明显相关的ATGs 主要分为4 大类［8，9］：（1）Atg1/unc-51 样激酶起始复合物（ULK1），包括ULK1、ATG1（酵母）和Atg101，哺乳动物中通过ULK1 作用于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）调节自噬启动；（2）Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶成核复合物，包括Atg18/Atg2 复合物、PI3KC3、Vps34、Beclin-1 和Atg6，其参与吞噬泡核心的形成；（3）微管相关蛋白轻链3 和两种泛素类复合物（LC3/ATG8、Atg5-Atg16L1-ATG12），参与自噬体延伸；（4）跨膜相关蛋白（ATG9、Atg18、WIPI-1 和VMP1）调控自噬体成熟。形成的自噬体与溶酶体融合，结合产生自噬溶酶体复合物，通过蛋白水解酶分解包绕的物质，有效成分再次重吸收利用。自噬的激活依赖于mTOR 与ULK1 复合物解离。自噬调控途径包含以下3 个途径：（1）mTOR 途径：该途径通过mTOR抑制Atg1 募集Atg13、Atg17 从而抑制自噬，mTOR是自噬诱导的主要调节靶点，雷帕霉素是常用的mTOR 抑制剂，通过抑制mTOR 位点的激活，可调控自噬强度［10，11］；（2）由Atg6/Beclin-1 介导途径：其与Ⅲ类PI3K Vps34 形成复合物，Vps34 是3-甲基腺嘌呤药物抑制剂靶点，同时Beclin-1 是自噬和细胞凋亡途径之间的重要接口，抗凋亡蛋白Bcl-2 及Bcl-XL 结合Beclin-1 可抑制自噬［12］；（3）两个泛素样结合过程途径：Atg7 和Atg10 介导Atg12 与Atg5/19的结合，随后与Atg16/20 相互作用，第2 个关键的共轭反应涉及Atg8 或微管相关蛋白轻链3（LC3）［13］。

2 自噬在感染性因素所致ALI 中的作用

2.1 铜绿假单胞菌（PA）感染所致的ALI

PA 是一种机会致病性革兰阴性杆菌，且是细胞外病原体。膜联蛋白家族成员Annexin A2（AnxA2）在多种细胞（如内皮细胞，单核细胞，巨噬细胞）中表达，AnxA2 在非小细胞肺癌，慢性阻塞性肺疾病（COPD）和慢性炎性疾病等肺部疾病中发挥多种作用，同时参与多种细胞的功能表达；抑制AnxA2 活性，腹膜巨噬细胞的吞噬能力降低，提示AnxA2 参与巨噬细胞的内吞作用和EGFR 介导的信号转导［14，15］。使用野生型小鼠与AnxA2-/-小鼠比较发现，PA 感染后AnxA2-/-小鼠的存活率降低，炎症反应更加明显，肺实质损伤更加严重［16］。IFNγ 与铜绿假单胞菌感染相关，通过使用IFN-γ 预处理细胞可以增强自噬，导致细菌存活率降低，但当敲除Beclin-1 的表达后，细菌清除率减少，提示抑制自噬可减弱肺巨噬细胞（AMs）杀伤功能［17］。PA 诱导的自噬作用由AnxA2-Akt1-mTOR-ULK1/2 和Beclin-1-ATG7-ATG5 信号通路介导［17，18］。近年研究示，PA 激活Toll 样受体2（TLR2）通过Src 激酶Lyn 介导AMs 的异种吞噬降解，同时Wnt5A-Rac1-Disheveled 通路也被用于诱导AMs 的异种吞噬［19，20］。由此可知，PA 感染引起ALI 时，上调自噬有利于细菌清除，减轻肺部炎症反应，对机体有保护性作用，AnxA2基因表达、Beclin-1-ATG7-ATG信号通路活化、TLR2 激活等参与了PA 感染启动自噬的过程。

2.2 H1N1 病毒感染所致的ALI

研究报道H1N1 病毒感染会促进circular RNA GATA Zinc Finger Do-main Containing 2A（circ-GATAD2A）的表达，circ-GATAD2A 的形成通过抑制自噬促进病毒复制；敲除Vps34基因，抑制Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶成核复合物的形成，亦可促进病毒复制，加重肺损伤［21］。上皮细胞感染甲型流感病毒后，人肺上皮细胞中Atg8/LC3-Ⅱ自噬标记物明显增加，流感病毒感染抑制自噬体与酸化LAMP1溶酶体的融合，从而阻止了自噬底物的降解；病毒M2 蛋白以Atg6/Beclin-1 为靶点，干扰Atg6/Beclin-1 和PI-3 激酶复合物结合，并通过与LC3 之间的相互作用抑制自噬体与溶酶体融合，阻断自噬体的降解，自噬下调导致病毒感染的肺组织细胞死亡和病毒释放增加［22］。现今治疗药物如奥司他韦等，研究表明［23］奥司他韦可通过诱导H1N1 病毒自噬，达到清除病毒目的。以上提示H1N1 感染引起ALI 机制与自噬功能减弱相关，上调自噬表达可提高机体对病毒清除能力，减少病毒释放，达到治疗H1N1 引起ALI 的作用。

2.3 H5N1 病毒感染所致的ALI

H5N1 通过TAK1-MKK4 途径诱导JNK 磷酸化，进一步磷酸化Bcl-2 后促进Bcl-2-Beclin1 复合体解离，JNK 信号通路的激活可上调自噬水平，促进病毒复制［24］。研究发现，H5N1 病毒亦可通过活化Akt-TSC2-mTOR 信号通路调节自噬，感染病毒时人肺A549 细胞自噬标志分子LC3-Ⅱ表达增多，使用3-MA 和Atg5siRNA 抑制细胞自噬时，可提高A549 细胞活力，减轻肺损伤［25］。禽流感病毒可导致肺上皮细胞自噬性死亡，其诱导自噬死亡可能通过激酶AKT、肿瘤抑制蛋白TSC2 和mTOR 靶点等途径，通过特异性的自噬抑制剂能够缓解H5N1 引起的细胞自噬性死亡以及小鼠的急性肺损伤［25，26］。上述研究提示自噬水平与病毒复制呈正相关关系，过度自噬与ALI 密切相关，下调自噬表达可抑制病毒复制，减轻肺损伤。但部分研究表明特定方式诱导自噬能够抑制甲型流感病毒复制，如Tu 延伸因子（TUFM）可以作为抑制禽流感病毒在人体细胞中复制的宿主限制因子，与NLRX1 相互作用增强自噬，通过介导自噬作用阻止禽流感病毒在人体细胞中的复制［27］。

2.4 新型冠状病毒（COVID-19）感染所致的ALI

新型冠状病毒属βCoV，新型冠状病毒引起ALI 的形成是患者死亡的主要原因。研究证实βCoV 通过NSP6（非结构蛋白6）在感染细胞中诱导ATG5 依赖性自噬体的形成，并通过自噬体的双膜囊泡（DMV）进行复制［28，29］。对COVID-19 基因组序列进行分析，发现NSP6基因突变，其作为一种多通路跨膜蛋白，表面有多个苯丙氨酸残基，通过与内质网（ER）膜相结合，破坏自噬体对病毒的降解，同时NSP6基因表达对自噬体的形成有诱导作用［30］。在病毒感染时，未折叠蛋白（UPR）可在内质网中积累被激活，其作为病毒蛋白来源，参与双膜囊泡形成并协助病毒复制，此外UPR 和自噬相互关联，诱导UPR 可促进自噬，因此COVID-19 感染可能通过UPR 诱导细胞自噬［31，32］。自噬抑制剂阻止自噬体与溶酶体融合，抑制自噬通量进而上调自噬体的积累，自噬体可诱导病毒感染细胞的凋亡，并扰乱病毒复制周期，当病毒感染期间存在自噬抑制剂时，多个过程的干扰可对病毒的复制进行遏制；结合氯喹作为抗病毒药物的作用机制，表明这些自噬抑制剂可能会中断病毒生命周期的早期步骤，即病毒与溶酶体的融合，从而减少病毒复制并保护细胞免受病毒诱导的细胞死亡［33］。综上，新型冠状病毒上调自噬为其复制提供基础，加速细胞死亡，加重肺组织细胞损伤，抑制自噬可能作为治疗新型冠状病毒的方案之一，不过还需要更多的研究来阐明这些自噬抑制剂与COVID-19 的确切作用机制以及在病毒生命周期不同阶段的影响。

2.5 脂多糖（LPS）所致的ALI

LPS 是一种病原体相关分子模式（PAMP），能够识别细菌入侵并激活先天免疫系统。LPS 刺激可调节肺上皮细胞、肺内皮细胞和AMs 的自噬，Atg4b 缺乏小鼠，经LPS 刺激后ATF3 活性减弱，肺对LPS 介导的损伤敏感性增加；LPS 可增加肺微血管内皮细胞的通透性，加重炎症渗出，这是引起ALI临床表现的原因之一，使用siATG5、siATG7 或氯喹抑制自噬后，可显著增加肺微血管内皮细胞通透性，加重LPS 诱导的小鼠肺损伤，提示自噬在LPS诱导的肺损伤中具有保护作用［34，35］。研究报道TLR4或MYD88基因敲除小鼠，可有效地降低LPS诱导的MTOR 激活，并增强自噬相关标志物LC3B，且研表明MTOR 正调控细胞NF-κB 的激活，提示LPS 可通过激活TLR4/MYD88-MTORNF-κB 信号通路抑制自噬，并调节炎症因子释放［36］。同时AMPK 是mTOR 的抑制剂和自噬激活剂，AMPK 通过磷酸化TSC2（mTOR 抑制剂）抑制mTOR 的激活，从而阻止ULK1 的抑制性磷酸化并促进自噬表达，LPS 诱导AMPK 失活从而导致mTOR 活化增强、ULK1 活性降低，使自噬受到抑制［37］。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）是一个对细胞内钙离子浓度敏感的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，CaMKKβ 可作为AMP 激酶的上游激酶，并通过Bcl-2 上调细胞内钙离子浓度从而调节自噬；激活的CaMKIα 可磷酸化AMPK，形成CaMKIα-AMPKATG7 复合物，该信号通路介导的自噬显著减弱了LPS 诱导的肺中性粒细胞炎症［38］。脂毒素（Lipoxins，LXs）是由免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）合成的内源性脂质，具有抗炎和促分解作用，肺微环境中LXs 的增加促进中性粒细胞凋亡，同时增强巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬/清除，具有抗炎和促分解双重作用；研究发现BML-111（脂蛋白A4 受体激动剂）通过MAPK 刺激AMs 的自噬并抑制凋亡，减轻ALI 相关的炎症和组织损伤［39］。综上所述，在LPS 引起的ALI 中，自噬作为一种防御、应激机制，有利于维持肺微血管内皮细胞通透性，减轻炎症反应，改善肺水肿症状，延长存活时间。适度增加自噬可作为LPS 诱导ALI 的一个潜在治疗靶点。

不过在部分研究中利用3-MA 抑制自噬后LPS诱导的小鼠肺部炎症反应被显著抑制；LPS 激发自噬促进肌动蛋白细胞骨架重排和VE 钙黏蛋白裂解进而破坏肺血屏障功能，抑制自噬可阻止VE 钙黏蛋白的分解而减轻屏障功能障碍，并改善LPS 作用后的肺血管损伤；研究证实敲除Atg5基因小鼠可通过减弱LPS 对中性粒细胞颗粒内容物的释放诱导，减轻炎性因子对肺内皮细胞屏障破坏以及炎症反应，从而减轻ALI［40］。研究表明通过抑制p38 MAPK 活化及TLR4/NF-κB 信号通过激活，可下调自噬作用并减轻炎性因子水平，改善肺功能［41，42］。分析其原因为LPS 可促进中性粒细胞过度自噬，刺激颗粒内容物释放，增加肺微血管通透性，使用3-MA 处理能抑制TLR4/NF-κB、p38 MAPK 激活，减轻ALI，表明过度自噬亦是LPS 引起ALI 的机制之一。

2.6 脓毒血症所致的ALI

在盲肠结扎穿刺诱导的脓毒血症小鼠模型中，脓毒血症小鼠肺部的LC3-Ⅱ、ATG5 和ATG7 水平下调，这表明脓毒血症可能抑制自噬；使用雷帕霉素或活化蛋白C（APC）刺激自噬可减少炎症和减轻肺损伤，提示上调APC 自噬可成为治疗脓毒血症的潜在靶点［43］。研究发现低生理剂量的一氧化碳（CO）可通过增强肺上皮细胞中Beclin-1 依赖的自噬过程，从而提高脓毒血症小鼠的存活率，而敲除Beclin-1基因小鼠CO 对脓毒血症保护作用减弱［44］。部分研究发现脓毒血症小鼠肺部的LC3-Ⅱ水平显著升高；与野生型小鼠比较，高表达LC3基因的小鼠表现出加速自噬体与溶酶体的融合，并在CLP 后存活时间延长，研究得出自噬在脓毒血症中的作用可能与自噬通量有关：自噬通量的保存对脓毒症有细胞保护作用，而自噬通量受损导致的自噬体积累可能是脓毒血症晚期肺损伤的原因之一［45］。综上，自噬在脓毒血症引起的ALI 中起保护作用，适当调节自噬可有效减轻脓毒血症性肺损伤。

2.7 炎症小体与自噬

炎症小体是一类由细胞内的模式识别受体（PRRs）即NOD 样受体（NLRs），包括危险相关分子模式（DAMPs）和致病原相关分子模式（PAMPs），集合成的大分子复合物［46］。在细菌、病毒、真菌等微生物感染及二氧化硅、石棉等微小有毒颗粒的刺激下可激活NLRP3［47］。NLRP3 被启动激活后，装配完成的NLRP3 炎症小体可以分裂无活性的caspase-1 成有活性的caspase-1，激活的caspase-1 可以将pro-IL-1β 及pro-IL-18 剪切成有活性的IL-1β 和IL-18，并释放到细胞外［48］。IL-1β 及IL-18 可刺激炎症因子产生、调控巨噬细胞和中性粒细胞积聚，并引发炎症的“瀑布效应”损伤肺泡上皮细胞，导致肺泡通透性增加增加肺水肿发生率。

病原体感染及其相关产物可引起体内炎症小体的激活，失控的炎症反应与急性肺损伤密切相关。LPS、脓毒血症致ALI 血浆中高表达caspase-1、IL-1β 及IL-18，提示LPS/脓毒血症可引起依赖caspase-1 的炎症小体途径被激活，而且循环中IL-18 的增加与疾病严重程度和死亡率相关；同时LPS 可通过NF-κB 信号通路上调巨噬细胞表面的IL-1RI 的表达，导致肺泡巨噬细胞的焦亡并加重肺部炎症［49，50］。NLRP3 炎症小体一方面可刺激炎性因子释放、另一方面可激活巨噬细胞加重肺损伤。在LPS 诱导ALI 发生中，自噬缺陷小鼠巨噬细胞内大量异常线粒体聚集，激活NLRP3 炎症小体，小鼠死亡率增加；Atg7基因敲除小鼠及自噬蛋白Atg16l1缺陷小鼠与野生型小鼠比较，其体内NLRP3 炎症小体被激活，IL-1β、IL-18 表达增加，提示自噬可通过调节炎症小体活性，减少炎性因子释放［51］。受损线粒体DNA 是激活炎症小体主要因素之一，lc3b-/-或Beclinl+/-巨噬细胞易聚集生理异常的线粒体，并产生大量的活性氧（ROS），在LPS 作用后线粒体容易发生更严重的结构紊乱和功能障碍，刺激炎症小体激活及炎性介质释放，提示自噬通过清除诱导炎症小体活化成分而抑制其激活［52］。由此可见，病原体感染可引起炎症小体活化，促进炎症因子释放甚至引发“炎症瀑布效应”，增强自噬可清除激活炎症小体活化成分，减轻炎症反应对肺组织细胞损害。

3 自噬在非感染性因素所致ALI 中的作用

3.1 氯气（Cl2）所致的ALI

Cl2暴露于肺上皮细胞可导致线粒体功能障碍和ROS 积聚，这可能是肺损伤的主要原因［53］。研究显示Cl2可促进线粒体超氧化物形成，进而影响线粒体耗氧量、膜电位和糖酵解，并抑制线粒体转运链中的复合物活性；Cl2干预细胞后其自噬标志物LC3。

BII 水平升高，p62 蛋白水平降低，p62 水平的降低被认为是自噬的表现，使用自噬激活剂（海藻糖）干预Cl2暴露后的细胞发现其线粒体呼吸功能得到改善；相反利用3-MA 处理暴露Cl2后的细胞可进一步出现生物功能障碍［54］。这些结果表明，Cl2暴露导致自噬增加，而自噬在Cl2诱导的肺损伤中具有保护作用，适当增强自噬对Cl2引起的ALI 起到保护作用，其机制可能是通过诱导自噬防止线粒体损伤、减少炎症和改善Cl2毒性。

3.2 急性胰腺炎（AP）所致的ALI

AP 通过激活TLR4/NF-κB 信号通路，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子释放，进一步募集炎症细胞及促进炎症反应的发生，全身炎症反应是急性胰腺炎病理特征，亦是导致ALI 的主要原因［55］。Diakopoulos 等［56］通过Atg5基因缺失小鼠发现，正常自噬在维持胰腺稳态中发挥重要作用；异常自噬是引起AP 病理损伤的关键点，AP 期间会导致自噬通量受损，大量自噬小体聚集活化胰蛋白酶原，提示AP 与自噬通量受损密切相关［57］。AP 期间产生的大量炎性介质及细胞因子作用于Toll 样受体，活化NF-κB 信号通路，级联产生大量炎症因子，导致局部或全身爆发性炎症反应；自噬功能受损，对炎性介质清除能力显著减弱，并进一步激活炎症小体加重炎症反应损害组织细胞；敲除Beclin-1 的小鼠NF-κB 活化程度和TNF-α 生成均较野生型小鼠增加［58］。同时自噬受损时p62 得不到及时降解，p62可进一步引起NF-κB 活化，释放大量炎症因子，加重组织损伤。综上，急性胰腺炎与异常自噬息息相关，并通过激活TLR4/NF-κB 信号通路调节炎症反应加重肺组织损伤，但自噬功能受损与AP 之间的因果关系尚未明确，提示可能通过调节异常自噬，进而抑制NF-κB 通路激活达到治疗AP 致ALI 的目的。

4 展望

目前关于自噬在ALI 中作用的研究已取得较大进展，且在不同模式ALI 中自噬发挥不同的作用，但其具体分子机制仍需进一步探索。ALI 起病迅速，病情凶险，目前尚缺乏针对ALI 的确切有效疗法，以抑制或激活自噬为治疗手段对多种因素致ALI 起到积极作用，同时抑制自噬可能为有效治疗新型冠状病毒提供新思路。目前关于自噬研究大多基于细胞或动物实验，将上述治疗手段转化到临床应用尚需漫长探索。未来研究需探索自噬在人体表达程度的特异标志物，为实现调节自噬表达达到治疗疾病目的提供基础。

作者贡献度说明

李秋呈：收集相关文献及论文书写；周向东：文章项目构思及审核；其余作者参与文献收集、分析。