Tet调控Th17∕Treg细胞分化参与自身免疫性疾病发病的研究进展

姜冠桐 周瑾 薛海波 滨州医学院附属医院内分泌科，滨州 56603； 烟台毓璜顶医院内分泌科，烟台64000

通信作者：薛海波，Email：xuehaibo@sina.com

CD4+T 细胞在自身免疫性疾病（autoimmune diseasas，AID）发病机制中发挥重要作用，辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）及调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）在T细胞亚群中也起着关键作用。Th17通过产生特异性细胞因子白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）发挥促炎作用，而Treg 对于抑制炎性反应及维持免疫稳态至关重要。大量研究证实，Th17∕Treg平衡失调与多种AID发生关系密切，包括类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）以及自身免疫甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）等。Tet 是Fe2+和氧戊二酸依赖性双加氧酶，其家族蛋白包括Tet1、Tet2 和Tet3，研究证实Tet 蛋白通过DNA 去甲基化调控Th17 及Treg 细胞分化参与免疫炎性反应的发生［1-2］。本文就AID中Tet对Th17∕Treg平衡调控机制的研究进展作一综述。

Th17、Treg细胞分化

在自身免疫炎性反应中，CD4+T 细胞通过分泌促炎细胞因子、聚集其他先天免疫细胞和诱导细胞裂解导致机体炎症性疾病。在T 细胞受体（T cell receptor，TCR）被激活后，CD4+T 细胞可以分化成Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T 细胞（T follicular helper，Tfh）和Treg等不同的T细胞亚群［1］，其中Th17∕Treg细胞免疫平衡为近年研究的热点。

1、Th17

Th17的特征在于视黄酸相关孤儿受体（ROR）γt转录因子的表达［2］并产生特异性细胞因子IL-17A。其分化及稳定表达受多种细胞因子及信号通路的调控。炎症因子以及转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以激活信号转导和转录激活因子3（signal transduction andactivator of transcription 3，STAT3），从而诱导转录因子RORγt 的表达并促进Th17 细胞分化和成熟［3］。其次，由Th17 产生的其他细胞因子IL-2 与TGF-β 可参与Th17 细胞分化的微环境组分共同诱导Th17 分化，以正反馈的方式进一步促进这一过程［4-5］。

2、Treg

Treg 具有高表达的CD25 和特异性转录因子叉头盒P3（forkhead box protein 3，Foxp3）［6］，在维持免疫稳态中发挥至关重要的作用。Treg可分为天然型调节性T细胞（natural Treg，nTreg）或称胸腺产生的胸腺调节性T 细胞（hymus regulatory T cell，tTreg）、外周产生的 外周调节性T 细胞（peripheral regulatory T cell，pTreg）和细胞培养物中TGF-β诱导的诱导性调节T 淋巴细胞（induced regulatory T，iTreg）。Shevach 和Thornton［7］的小鼠研究证明，tTregs 通过递送与GARP 结合的TGF-β 来启动感染耐受性，从而产生抗原特异性pTregs，而iTregs 通过多种机制抑制效应T 细胞的活化。Treg 细胞分泌的主要细胞因子包括IL-10，TGF-β 和IL-35有助于免疫抑制、抑制自身免疫性疾病以及慢性炎症的发生、发展。

Th17/Treg平衡

Th17 和Treg 细胞分化由TGF-β 介导的共同信号通路调控，Th17 能够促炎性反应，而Treg 通过产生抗炎细胞因子IL-10、IL-35 以及TGF-β 等抑制多种免疫细胞的活性进而诱导免疫耐受，抑制机体的免疫反应。因此，这两个作用相反的CD4+T细胞亚群的免疫失衡参与了多种自身免疫性疾病的发病机制。

1、Th17∕Treg平衡调节

Th17∕Treg 平衡受多种信号通路、微生物群、代谢、Foxp3 的稳定性等调控。IL-6 与TGF-β 一起诱导Th17 分化，同时IL-6 抑制TGF-β 诱导的Treg 分化［8］；Takeuchi 等［9］通过对自发型AID 小鼠模型（SKG 小鼠）实验研究发现，TCR 信号异常可在不同程度上影响Th17 和Treg 的发育和功能从而引起多种免疫疾病；Cluxton 等［10］研究发现，糖酵解和脂肪酸合成能够促进Th17 细胞分化，而Treg 细胞分化更依赖于糖酵解和氧化磷酸化，考虑抑制糖酵解或脂肪酸合成会使Th17∕Treg 轴向Treg 移动。另外，Westfall 等［11］用来自30 多个人类供体的粪便微生物群定植无菌小鼠，证明了IBD 供体的人类肠道微生物群可导致Th17∕Treg 平衡失调。

2、Th17∕Treg平衡与AID

目前越来越多的研究证实多种AID 是由Th17 驱动并由Treg 抑制的。Paradowska-Gorycka 等［12］通过对45 名RA患者、27 名骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者和46 名健康对照组研究发现，OA 患者中Th17 细胞比例是Treg 细胞的5～6 倍，证实Th17∕Treg 细胞失衡与RA 患者关节的自身免疫、慢性炎症和关节破坏有关。Yan 等［13］研究报道，Th17∕Treg细胞轴的失衡会导致IBD 的发生，Th17 通过促炎细胞因子加剧肠道炎性反应，Treg 比例的减少可能是IBD 发病机制的核心环节。Yuliasih 等［14］在30 名SLE 女性患者中的研究发现，与健康女性相比，SLE 患者中Th17 比例明显升高，而Treg 比例相对较低。另外，多项研究证实，Th17 和Tregs 的平衡失调可参与甲状腺自身免疫损伤，与AITD 发生、发展及疾病的严重程度关系密切［15-17］。

Tet蛋白介导DNA去甲基化

DNA 甲基化是一种表观遗传因素，在胚胎发育和许多疾病的发展中发挥重要作用。Tet蛋白是一种去甲基化酶，自发现至今仍为研究热点之一。Tet 蛋白能够催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）进一步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-fC）至5-羧基胞嘧啶（5-caC）［18］。Tet蛋白介导的5-mC 氧化可以通过促进活性DNA 去甲基化和被动DNA 甲基化稀释来动态调节全局或位点特异性5-mC 和∕或5-hmC 水平，从而调节基因表达。Tet 蛋白家族包括Tet1、Tet2、Tet3，并且具有不同的结构和功能。

Tet1是介导DNA 去甲基化的关键因素。Tet1对于维持胚胎干细胞的分化也至关重要，并且在不同肿瘤中可与不同的信号通路相结合，起着抗癌或致癌作用［19］。Sun 等［20］通过对敲除Tet1 基因的小鼠实验发现，小鼠胚胎干细胞中Tet1 可调节促炎细胞因子基因启动子区域中的5-hmC，从而激活巨噬细胞进而导致慢性炎症性疾病的发生。Tet2 的突变和失调导致血液系统多种恶性肿瘤的发展［21］。此外，关于Tet2 通过促进DNA 去甲基化在慢性炎症及先天免疫中的作用也已开展了多项研究［22］。Montagner 等［23］报道，Tet2 是肥大细胞分化和增殖的关键调节，在没有Tet2 的情况下，肥大细胞表现为基因表达中断和全基因组5-hmC 沉积的改变，虽然实验证实在没有Tet2 的情况下，Tet 家族的其他成员仍可以调控肥大细胞的分化，但其增殖却是仅依赖于Tet2 的表达。Tet3 在包括造血细胞在内的体细胞中也有大量表达，但与Tet2 不同的是，Tet1 和Tet3 均具有N 端CXXC DNA 结合结构域。Lio 等［24］通过敲除Tet2∕Tet3 后的小鼠实验证实，Tet2 和Tet3 通过调节Igκ 轻链的转录和重排，并与B 细胞特异性转录因子协同作用以促进DNA 去甲基化和B 细胞增强子的染色质可及性，证实在B 细胞分化过程中，Tet2和Tet3协调B细胞成熟和功能。

Tet调控Th17/Treg平衡

在被抗原激活后，CD4+T 细胞分化成包括Th1、Th2、Th17和iTreg细胞的辅助T细胞的不同亚群之一，Tet介导的活性DNA 去甲基化是调节Th 细胞功能的基本表观遗传机制。

1、Tet调控Th17细胞分化和功能

如前所述，Tet 蛋白通过将5-mC 转化为5-hmC 来改变DNA 的甲基化状态。Ichiyama 等［25］通过分析各种Th 细胞中5-hmC 的全基因组图谱发现，5-hmC 存在于Th 细胞亚群特异性基因的假定调节元件中。同时他们的实验证实了Tet2 的缺失抑制了Th17 细胞的效应细胞因子表达。同时发现，Tet2 在Treg 的非编码序列（CNS）2 与IL-17a启动子区域中的关联与这些位点存在5-hmC 相关。另外证实，Tet2 在Th17 细胞中以RORγt依赖性方式诱导IL-17 位点的DNA去甲基化来调控Th17∕Treg平衡。

2、Tet调控Foxp3稳定表达及Treg细胞分化

Hori 等［26］证实，Foxp3 是Treg 细胞的主要转录因子，表达Foxp3 的Treg 在维持自身耐受和免疫稳态中发挥关键作用［27］。基因序列分析显示Foxp3 基因座中有3 个高度保守的非编码序列（CNS）元件，其受到表观遗传修饰的影响并参 与 调 节Foxp3 转 录 进 而 影 响Treg∕Th17 细 胞 平 衡［28］。Zheng 等［29］发 现，CNS1 仅 在 外 周CD4+T 中 发 挥 诱 导Foxp3 的作用，CNS2 通过去甲基化维持Foxp3 表达的稳定性，而CNS3能够有效增加CD4+T细胞在胸腺和外周分化过程中Foxp3基因表达。

表观遗传变化在建立和维持Treg细胞分化及维持其稳定表达发挥着关键作用［30］，Foxp3 表达的稳定性与CNS1 和CNS2 的去甲基化状态密切相关。在胸腺中的Treg 细胞发育过程中，Tet 蛋白介导Treg 细胞特异性低甲基化区域中5-mC的损失，其中主要表现在Foxp3位点中CNS1和CNS2。

Nakatsukasa 等［31］研究证实，Treg 中的Tet2∕Tet3 缺乏可导致小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+T 细胞的过度增殖，并在Foxp3 上游增强子中发现了新的Tet 依赖性去甲基化位点CpG，这可能有助于稳定的Foxp3 表达。同时证实，Tet 蛋白调节成熟Tregs 中的Foxp3 稳定性，使CD4+T 向Th17细胞分化从而导致Th17∕Treg细胞平衡失调。

有研究在小鼠中特异性敲除Tet2 和Tet3 后发现，Treg中缺乏Tet2 和Tet3 的小鼠较正常小鼠存活时间短，小部分存活时间较长的小鼠表现出脾大及淋巴结肿大［32］。流式细胞学分析发现，Tet 功能丧失小鼠的Treg 与野生型小鼠Treg相比，Foxp3 中CNS1 和CNS2 增强子的甲基化增加导致Foxp3 表达的稳定性降低，进而导致Treg 细胞功能受损，同时Tet2∕Tet3 缺乏导致Tfh 和∕或Th17 细胞分化相关的基因表达增加。

所有Tet 家族成员很可能在CNS2 去甲基化和Foxp3 稳定性中协同发挥作用，因为Tet1∕Tet2双缺陷的Tregs也具有增加CNS2甲基化进而导致Treg稳定性和功能性的丧失，进而导致炎症和自身免疫损伤的增加。有研究报道，硫化氢（H2S）是Foxp3+Treg 细胞分化和功能所必需的，并且证实H2S 通过硫酸化核转录因子Y 亚基β（NFYB）来维持Tet1 和Tet2 的 表 达 以 促 进 其 与Tet1 和Tet2 启 动 子 的 结 合［33］。Tet1 和Tet2 催化Foxp3 中5-mC 转化为5-hmC，以建立Treg特异性低甲基化模式和稳定的Foxp3 表达。因此，Tet1 和Tet2缺失导致Foxp3高甲基化、Treg细胞分化和功能受损以及Th17∕Treg 平衡失调，最终参与自身免疫性疾病的发生发展。

Someya 等［34］研究证实，Foxp3 在tTregs 中的表达通过Foxp3 位点CNS2 区域的CpG 岛的去甲基化来稳定，因为CNS2 的去甲基化导致各种转录因子的募集，而Foxp3 在iTregs 中的不稳定表达被认为与CNS2 的强甲基化有关，但目前有关于CpG 岛功能的研究尚未完全阐明。同时他们通过实验发现低氧条件（5%的氧浓度）增加了小鼠CD4+T 细胞中所有Tet mRNA 的表达水平，进一步保证了小鼠体内Foxp3稳定性和更高的抑制活性。另外，保证机体的氧供给对于Tet 酶活性也很重要，因为5-mC 的羟基化需要氧气的参与。

有研究发现，Tet蛋白介导Treg 细胞特异性低甲基化区域中5-mC 的损失，维生素C 促进人Foxp3 的CNS2 中5-mC损失，增强iTreg 细胞的稳定性［35］。维生素C 能够增强Tet活性并通过Tet2∕Tet3 发挥作用，同时增加TGF-β 诱导的T细胞中Foxp3表达的稳定性，进而诱导Treg细胞的分化。

此外，有研究发现，维生素C 以Tet2 依赖性方式诱导Tregs 中 的CNS2 去 甲 基 化［36］。在 使 用 维 生 素C 培 养 的iTregs 中，5-mC 转 化 为5-hmC 的 效 率 更 高，Foxp3 中CNS2 的CpG 的甲基被迅速擦除，但在对照组中则没有这种现象。因此，维生素C 也是Tet 蛋白介导的CNS2 去甲基化所必需的，对Foxp3稳定表达以及Treg细胞分化至关重要。

综上所述，Foxp3 中CNS2 的DNA 去甲基化对Tregs 分化成熟起重要的作用，而Tet 蛋白通过影响Treg 细胞中的Foxp3 稳定表达调控Treg 和Th17 的细胞分化和功能。T 细胞Tet2∕Tet3 或Tet1∕Tet2 缺失会导致CNS2 去甲基化受损和Foxp3 稳定性降低，进而抑制CD4+T 细胞向Treg 细胞的分化，反而向Th17 细胞分化成熟，最终导致机体内Th17∕Treg细胞免疫平衡失调，进而参与一系列慢性炎性反应及AID的发生、发展。

结 语

Treg∕Th17细胞平衡失调是多种AID、慢性炎性反应、肿瘤等发生的基础，而表观遗传变化导致的免疫系统细胞基因表达异常可能导致免疫耐受丧失、炎症和自身免疫。维生素C和∕或低氧条件下能够使机体内的Tet蛋白稳定表达，同时使CD4+T 细胞趋向Treg 分化，更为重要的是，Tet 通过DNA去甲基化调控Foxp3的稳定表达进而改变Th17∕Treg细胞平衡参与自身免疫性疾病的发生。因此，针对Tet的深入研究可能为自身免疫性疾病发病机制的阐明以及疾病防治提供新的思路及方向。