基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路探讨益气活血法防治糖尿病肾病*

周吉，王子晨，阴永辉

1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014

近年来，在全球范围内，糖尿病的发病率逐年攀升。据国际糖尿病联盟（IDF）统计，2017年，全球糖尿病患者已达4.25亿［1］。糖尿病作为一种全球性的流行性疾病，严重威胁着人类健康［2］。机体长期处于高糖状态会导致各种慢性并发症的出现［3］，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常见且较难治的微血管并发症之一，是临床导致终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的重要原因［4］。氧化应激作为DKD重要病理机制，在该病的发生发展中起着关键的作用，Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）-抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）是氧化应激中重要的通路，具有抗氧化应激、保护机体免受损伤的作用，进一步研究此通路的作用机制对于防治DKD意义深远。DKD属中医“消瘅”“肾消”“水肿”“尿浊”等范畴，主要病机为气虚血瘀，以益气活血类单味中药治疗效果显著，而从现代医学机制探讨益气活血法治疗DKD具有中西医结合、相辅相成的优势，有助于提高患者生活质量。

1 氧化应激为DKD重要发病机制

临床上，DKD以蛋白尿持续增加以及肾小球滤过率逐步下降为主，最终发展至肾功能丧失，病理变化主要为细胞外基质过度生成、纤维化、炎症及内皮功能障碍等，可加剧肾小球肥大、基底膜增厚、系膜扩张、肾小管萎缩、间质纤维化和小动脉狭窄，最终导致肾功能下降或丧失。DKD的发病机制尚未明确，可能与高血糖、高血压、血脂异常、肥胖和遗传易感性等因素密切相关［5-7］。目前，国内外针对DKD发病机制的研究主要涉及氧化应激、炎症反应、线粒体损伤、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的积累、细胞自噬与凋亡、表观遗传学调控、内质网应激以及蛋白激酶C通路（protein kinase C，PKC）、多元醇通路（polyol path-way，PP）、细胞因子信号传导的酪氨酸蛋白激酶（Janus kinase，JAK）／信号转导子和转录活化子（signal transducers and activators of transcription，STAT）途径、转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等的激活［8-11］。而上述机制的失调归因于氧化应激强度增加［12］，故氧化应激被认为是DKD进展的核心机制，在该病的发生发展中发挥主要作 用［13-16］。活 性 氧 簇（reactive oxygen species，ROS）为分子氧经历一系列还原的生物合成过程所形成几个活性氧的中间产物，为内源性氧化物，在DKD的起始和进展中具有核心作用［17］，主要由各种还原型辅酶Ⅱ氧化酶（NADPH oxidase，NOX）、有缺陷的抗氧化系统及线粒体功能障碍介导产生［18］。氧化物过度产生，而抗氧化物生成不足，二者之间存在不平衡，活性氧比抗氧化剂多，致使体内自由基积累过多，引起氧化应激损伤。生理条件下，内源性抗氧化剂、外源性抗氧化剂与这些氧化剂相互作用，可抵消氧化应激导致的细胞损伤。在DKD患者体内，高血糖症、葡萄糖代谢失调、活性氧和肾素血管紧张素系统可通过酶促和非酶促途径促进氧化应激，超过机体抗氧化能力，导致细胞损伤，加剧了糖尿病并发症的发生。糖尿病患病期间，ROS升高不仅会增加蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤产物，还会引起组织含量和抗氧化防御系统活性的改变。高糖条件下，过量的活性氧能够调节各种细胞因子、转录因子的活化，导致肾脏中的炎症、细胞增殖、细胞外基质积累、纤维化、内皮功能障碍和异常血管生成［19］，肾小管及肾小球结构异常，肾脏血流动力学发生改变，最终导致DKD。

2 Keap1-Nrf2-ARE抗氧化通路

氧化还原失衡在DKD的发病机制中具有核心作用。若患者体内活性氧过量产生，抗氧化系统易随着氧化应激状态的出现而耗尽，超负荷的氧化应激会加重DKD进展，而抗氧化应激能够有效缓解及改善DKD［20］。实验证明，降低活性氧含量及增加抗氧化应激产物的水平，可有效缓解DKD进展［21-24］。作为抗氧化应激的核心，Nrf2在对抗氧化应激的防御系统中发挥关键作用，在抗氧化研究领域被认为是细胞保护基因转录的主要调节因子和启动因子，是预防氧化应激驱动的疾病如糖尿病及其终末期DKD的关键治疗靶点［25］。正常条件下，Nrf2通过与其抑制因子Keap1的物理作用而被隔离在细胞质中［26］。由于被Keap1蛋白的泛素化，Nrf2通常处于低表达的非活性状态。当受到活性氧刺激或激动剂激动时，泛素结合蛋白途径被激活［27］，Keap1与Nrf2的偶联状态被打破，Nrf2被激酶磷酸化，活化的Nrf2逐渐积累，并转运入细胞核，与Maf蛋白结合形成异质二聚体后，再与ARE结合［28］，激活靶基因表达，产生下游抗氧化应激相关蛋白因子，形成以Nrf2为核心的抗氧化应激通路，以抵抗过多的活性氧产生，改善氧化应激导致的肾损害。

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞防御氧化应激损伤的关键调节因子，作为DKD患者体内不可或缺的应对氧化应激的细胞防御途径越来越受到关注，其激活剂具有抗氧化应激效应，已成为治疗DKD的靶点［29］。

3 Keap1-Nrf2-ARE通路与DKD其他发病机制的联系

3.1 Keap1-Nrf2-ARE与足细胞损伤高糖诱导肾小球足细胞损伤是DKD重要的发病机制之一。足细胞是一种终末分化的肾小球上皮细胞，具有维持肾小球过滤屏障完整性、防止尿蛋白损失的作用。足细胞损伤会导致滤肾小球过率下降，肾功能损伤。研究发现，高糖环境能够使机体上调肾小球足突细胞中溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）水平，BRD4过表达会加重高糖诱导的足突细胞损伤［30］。BRD4抑制Nrf2／ARE活性后，高糖诱发的凋亡和活性氧产生明显被抑制，Nrf2核易位加速，Nrf2／ARE的转录活性上调，机体抗氧化能力提高，足细胞对高糖损伤的细胞保护作用明显增强，说明BRD4抑制剂通过降低BRD4水平，可增强Nrf2／ARE转录活性，具有保护足细胞的作用。实验研究发现，经布鲁塞尔处理的小鼠Nrf2-Keap1途径失活后，小鼠足细胞凋亡显著增加，提示激活的Nrf2-Keap1信号通路能够保护谷氨酸和磷酸诱导的足细胞凋亡［31］。

3.2 Keap1-Nrf2-ARE与炎症反应炎症反应作为DKD重要的发病机制，贯穿疾病始终。DKD患者体内的高糖状态是刺激炎症发生的主要驱动力，而炎症细胞中的巨噬细胞被视为重要的参与者［32］，能够诱导肾脏固有细胞分泌白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化蛋白等大量促炎细胞因子，最终导致糖尿病肾损伤。信号通路核因子κB（nuclear factor kappa beta，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）、NOD样受体蛋白3炎症小体（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）等是介导炎症发生的经典途径［33］。有研究证实，Nrf2通过协调炎症细胞的募集和ARE调节基因表达促进抗炎进程，通过对炎症因子的负反馈调节，直接或间接地影响NF-κB等相关通路及其他炎症控制网络，Nrf2和NF-κB通路相互作用以调节下游靶分子，发挥转录与翻译功能［34-35］。可见，Nrf2-Keap1-ARE通路可通过调节抗炎基因表达，促进抗炎蛋白生成，从而抑制炎症的进展，达到延缓DKD发展的目的。

3.3 Keap1-Nrf2-ARE与AGEsAGEs引起的氧化应激被视为DKD病理进展的主要原因。长期高糖环境使机体中的蛋白质、脂质和核酸与过剩的还原糖形成不可逆的非酶糖基化终末产物AGEs，与其受体RAGEs相互作用，诱导氧化应激与炎症反应，导致肾纤维化，损伤肾脏功能［36］。Huang等［37］研究发现，沉默信息调节因子2相关蛋白1（silent information regulator factor2related enzyme 1，Sirt1）可以通过促进受AGEs攻击的肾小球系膜细胞中Keap1-Nrf2-ARE途径的激活，包括增加Nrf2的核积累、提高DNA的结合活性和转录活性、抑制纤连蛋白和TGF-β1上调，从而延缓糖尿病肾脏纤维化。由上可知，Keap1-Nrf2-ARE的激活能够改善肾小球系膜细胞中AGEs的水平，发挥肾脏保护作用。

3.4 Keap1-Nrf2-ARE与细胞自噬、凋亡细胞自噬是溶酶体水解酶降解细胞内的细胞器和大分子物质的动态生理性过程。病理条件下，氧化还原稳态的失调会导致活性氧产生，活性氧介导的氧化应激会导致细胞成分的氧化损伤，损害细胞器功能，此时细胞通过自噬消除功能失调的细胞器和受损的大分子物质，减轻氧化应激，以维持细胞稳态。高糖环境下，细胞过度产生活性氧，使正常细胞自噬无法恢复，导致过度自噬，损伤肾脏［38］。研究发现，萝卜硫素可以激活人肾小管细胞（human kidney-2，HK-2）中的Nrf2-HO-1通路，抑制ROS的产生，改善细胞自噬与凋亡［39］。Wang等［40］研究发现，高糖处理可显著促进HK-2凋亡，HK-2细胞活力降低，抗氧化酶活性受到抑制，活性氧的产生增加，而经药物干预，Nrf2途径激活，下游蛋白血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化还原酶1［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］水平升高，ROS的产生显著减少，HK-2凋亡延缓，细胞活力显著提高。研究表明，Nrf2通路与细胞自噬、凋亡存在密切联系，推断通过激活Nrf2能够在高糖损伤过程中抑制ROS产生和氧化应激损伤，改善细胞自噬和凋亡。

3.5 Keap1-Nrf2-ARE与线粒体功能障碍线粒体是一种动态细胞器，经历了由线粒体分裂基因、线粒体融合基因1、2及视神经萎缩蛋白1调节的频繁分裂与融合，维持线粒体动态平衡。线粒体功能障碍很大程度上加速了DKD的进展。DKD发生时，氧化应激会产生大量ROS，攻击线粒体膜，导致线粒体断裂和膜去极化，膜的通透性改变，膜电位下降，导致一系列细胞凋亡蛋白酶的级联反应，受损的线粒体产生大量ROS，并加速细胞凋亡，最终损伤肾脏。Xiao等［41］研究发现，线粒体靶向抗氧化剂米托蒽醌能够激活Nrf2的表达、活性和易位，并抑制Keap1表达及Nrf2、Keap1之间的相互作用，通过转录调节恢复管状细胞中的有丝分裂，改善线粒体氧化应激和异常线粒体代谢动力学，显著逆转糖尿病小鼠肾小管损伤。

除上述机制外，Keap1-Nrf2-ARE还与内质网应激［42］、表观遗传［43］等DKD的发病机制相关。研究发现，相应地激活Keap1-Nrf2-ARE通络能够调控以上机制，改善DKD。可知Keap1-Nrf2-ARE作为重要的抗氧化应激通路，通过调控氧化应激，能够多方面调节DKD发病机制，改善DKD。

4 气虚血瘀是DKD的基本病机

DKD可归属于中医“肾消”“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴［44］。《儒门事亲·三消论》曰：“夫消渴者，多变为聋盲疮癣痤疿之类……或水液妄行而面上肿也。”《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，能为水肿。”《灵枢·口问》云：“中气不足，溲便为之变。”可见，消渴日久会出现水肿、小便不利，发生DKD。本病病因与外感六淫、禀赋不足、饮食失宜、情志不调等有关［45］。DKD病理因素复杂，不同阶段的病机重点亦不同，但“气虚血瘀”贯穿疾病的始终。

4.1 气虚为DKD发生的基础条件气虚是DKD发生的关键病机［46］。自古就有医家以“阴虚燥热”为消渴的基本病机。《备急千金要方·消渴》云：“内消之为病，当由热中所致，小便多于所饮，令人虚极短气”，可见消渴虽由阴虚燥热所致，但最终导致了气虚的出现，而DKD是糖尿病日久的并发症，当以气虚为本。“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，《灵枢·五变篇》指出五脏虚弱是DKD的重要病因，《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证》载：“寸口脉浮而迟，浮即为虚，迟即为劳；虚则卫气不足，劳则营气竭，阳脉浮而数，浮即为气，数即消谷而大坚；气盛则溲数，溲数即坚，坚数相搏，即为消渴。”营卫之气虚弱导致消渴的发生，气虚是DKD的重要病机，书中所载白虎加人参汤、肾气丸治疗消渴，从病因病机、选方用药角度验证了气虚为消渴基本病机。DKD主要病位在肾，并涉及肺、脾二脏，三脏相互影响致病，饮食不节、情志不调等导致脾失健运，脾气虚，气血化生无源；脾气虚则土不生金，导致肺气虚；脾为后天之本，脾气虚，后天无以资先天，先天之肾失去濡养，则肾气虚［47］，日久三脏均会出现气虚，导致DKD的发生。

4.2 瘀血为DKD的果与因《血证论·瘀血》云：“瘀血存里则口渴……内有瘀血，故气不能通，不能载水津上升是以发渴，瘀去则不渴。”瘀血在DKD的发生发展中既是病理产物又是致病因素，贯穿DKD始终［48］。瘀血不去，消渴无愈，焦安钦认为，该病病机包含因虚致实、虚实夹杂，以肺气、脾阳、肾阴不足为本，以瘀、痰、湿、热为标，突出瘀血在疾病发展中的作用，强调“瘀血痹阻”的病机［49］。吴鑫等［50］认为，本病的根本为气血阴阳的亏虚，其标为燥热、瘀血、痰浊，而瘀血贯穿疾病始终。姜威等［51］认为，DKD乃消渴病迁延日久，脏腑受损，夹杂实邪，瘀血既是病理产物，又是致病因素，可见瘀血在DKD中具有重要地位。肺、脾、肾三脏气虚日久，气不能行血，血无力前行，血行不畅，日久成瘀；气不能摄血，血失统摄，血不循经，溢于脉外，留而成瘀；气虚不化，生化乏源，新血不生，脉管空虚，久而停瘀。瘀血形成，又会导致气滞、痰阻，气血化生乏源，如此往复，恶性循环。瘀血形成是DKD迁延不愈的结果，瘀血日久不散，作为病理产物又会使DKD日益加重，亦成了DKD发生的原因，如此往复，加重DKD的病情。

5 益气活血是DKD的重要治则

DKD为消渴气虚日久、脉络瘀阻所致，基本病机为气虚血瘀，属气血不和。针对“气虚为本，血瘀为标”的病机，益气活血治疗DKD标本兼顾，效果显著。

郭婷婷［52］整理益气活血法治疗DKD的临床研究文献30篇，通过对患者临床症状、指标等的Meta分析，发现辅以益气活血法治疗，能够显著提高临床疗效。罗粤铭等［53］收集广东省中医院杨霓芝门诊2007年至2017年DKD病历，通过对方、药等进行数据挖掘发现，杨霓芝治疗DKD以益气活血为主，疗效显著，提示益气活血法在DKD的治疗中占有重要地位，疗效显著［54-55］。

6 益气活血单味中药治疗DKD药理作用研究

目前，DKD尚无针对性的治疗方法，临床多以控制血糖和血压为基础，晚期以肾脏替代疗法为主［56］，尽早干预可有效延缓DKD的发展进程［57］。近年来，中医药治疗DKD在改善临床指标、缓解临床症状、延缓疾病进程等方面具有较大优势。孔畅［58］收集并筛选早期DKD的临床诊治处方，规范化处理后建立处方数据库，运用统计软件对处方进行用药频次分析，挖掘临床治疗DKD的组方规律和遣方用药特点。在收集整理的316首处方中，前6位高频药物依次为黄芪、当归、茯苓、丹参、白术、川芎，其中，补虚药物最多，其次为活血化瘀类药物。研究表明，益气活血类单味中药能够通过抗氧化、抗炎、抗细胞自噬、抗肾脏纤维化、改善血管内皮功能等作用，改善患者临床症状，减少尿蛋白，治疗DKD［59］。

6.1 黄芪黄芪是临床常用的补气圣药，善益气固表、利水消肿、敛疮生肌，临床广泛应用于DKD，具有改善胰岛素抵抗并增加敏感性、抑制淀粉酶活性、抗氧化、抗炎、调节免疫等诸多作用［60］。王静［61］研究发现，黄芪甲苷可能通过调节Nrf2通路抗氧化应激，改善高糖引起的DKD患者体内近端肾小管上皮细胞HK-2细胞毒性及氧化损伤。研究发现，黄芪甲苷干预高糖损伤的人肾小球系膜细胞后，可抑制其过度增殖的趋势，且检测到Nrf2、HO-1 mRNA等水平升高，过氧化氢、丙二醛等水平下降，与黄芪甲苷激活Nrf2通路密切相关［62］。

6.2 当归当归具有补血活血、调经止血、润肠通便之功效，因其既能补血又能行血，补血不留瘀，《景岳全书》中称当归“诚血中之气药，亦血中之圣药”，具有抗氧化、抗炎、护肝及改善血液循环等作用［63-64］。Saw等［65］研究发现，当归根具有抗炎作用，可激活Nrf2通路，保护机体免受氧化应激损伤。张利英等［66］通过动物实验发现，当归多糖可以提高辐射大鼠体内抗氧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性，缓解大鼠肾脏氧化应激损伤，这与Nrf2通路及下游因子的激活有关。

6.3 丹参丹参具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效［67］，是临床常用的活血化瘀类药物，具有改善血液循环、降脂、护肝、镇痛、抗炎、抗氧化、免疫调节作用［68］。研究发现，丹参可呈剂量依赖性促进Nrf2核聚集，增加细胞抗氧化能力［69］。徐春阳［70］研究发现，丹酚酸A可与Nrf2蛋白的多个活性位点直接结合，显著促进Nrf2核转位，上调抗氧化基因SOD、GSH-Px mRNA表达，产生抗氧化应激效应。An等［71］发现，丹参乙酸乙酯提取物可以减少实验性DKD模型的蛋白尿，改善肾功能，并减轻肾小球内的病理改变，这与其增强了介导抗氧化反应的Nrf2及其下游基因HO-1和NQO1的表达，同时降低体外和体内keap1的表达有关。

6.4 三七三七有化瘀止血之功效，具有止血不留瘀的特点。研究发现，三七有调节糖代谢、抗氧化、抗炎、抗纤维化、抗凋亡、抗动脉粥样硬化、降脂等药理作用［72］。Zhang等［73］研究发现，三七皂苷R1干预后，db／db小鼠肾脏球状体积和纤维化减轻，HK-2细胞凋亡缓解，提示三七皂苷R1能促进核Nrf2和HO-1表达，消除氧化应激诱导的细胞凋亡和逆转肾纤维化，延缓DKD进展。

6.5 红景天红景天具有养心、补肾、平喘之功效，红景天苷是红景天的主要单体和有效成分。研究发现，红景天通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、降糖、抗纤维化等途径延缓DKD的进展［74］。细胞实验发现，经红景天苷干预后，HK-2细胞的Bax蛋白表达水平减低，Bcl-2表达升高，caspase-3和caspase-9的活性降低，Nrf2水平升高，提示红景天苷通过促进Nrf2表达逆转了对照组AGEs诱导的HK-2细胞活性降低［75］。张雪松［76］研究发现，给予红景天苷干预的糖尿病大鼠Nrf2／ARE信号通路的激活状态增强，下游的抗氧化应激蛋白表达增强，且其血糖、蛋白尿、血肌酐等水平明显改善。

另有学者以链脲佐菌素诱导的C57BL／6小鼠模型研究川芎乙醇提取物对DKD的保护作用，证实川芎提取物是氧化应激和炎症的有效抑制剂，可能与Nrf2和NF-κB途径有关［77］。经姜黄素干预后，患者尿微量白蛋白排泄率显著降低，且不影响参与患者的代谢控制［78］。此外，姜黄素还能降低血浆丙二醇水平，增强患者血液淋巴细胞Nrf2系统特异性调控蛋白NQO1及其他抗氧化酶的表达。

综上，益气活血类单味中药具有改善糖代谢、抗氧化应激、抗炎症反应、抗纤维化、抗细胞凋亡等作用，能够通过作用于Keap1-Nrf2-ARE通路，激活下游抗氧化因子，降低氧化应激水平，发挥抗氧化应激作用，从而保护肾脏细胞免受氧化应激损伤，减轻肾损害，改善肾功能。

7 问题与展望

综上所述，DKD发病机制复杂，涉及多个方面，目前尚无针对性的治疗药物。大量药理研究证实，益气活血类中药具有降低尿蛋白、抗炎、抗氧化等改善糖尿病肾损伤的作用。目前，Keap1-Nrf2-ARE信号通路受到了广泛的关注，与DKD的很多发病机制具有相关性。本文综述了氧化应激、Keap1-Nrf2-ARE与DKD的关系以及DKD的病机和治法、益气活血单味中药通过激活Keap1-Nrf2-ARE通路治疗DKD等相关研究，发现益气活血类中药能够激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，下调活性氧含量，调控Keap1-Nrf2解离，促进Nrf2入核、激活ARE抗氧化应激元件以及调节下游抗氧化蛋白因子表达，改善DKD临床症状、降低尿蛋白、抑制炎症反应、保护细胞损伤、抗纤维化，发挥肾脏保护作用。通过中医辨证论治，突出了DKD“气虚血瘀”的基本病机，明确了益气活血法治疗DKD的有效性，为临床应用提供了新思路与新方向。

益气活血法在糖尿病肾病中应用较为广泛，其作用机制与激活Nrf2通路有关，进一步以Keap1-Nrf2-ARE通路为介导，从细胞、分子及上游基因调控层面研究糖尿病及其并发症具有更深层次的意义，然而相关研究较为匮乏。益气活血类中药已广泛应用于糖尿病及其并发症的临床治疗，但药物之间的相互作用及发生作用后对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响尚未明确。

针对DKD氧化应激的病理机制，可加强临床试验及动物实验，从单味中药、药对、中药复方之中寻找合适的抗氧化剂，以更有效地干预DKD进程。Keap1-Nrf2-ARE信号通路的激活能够促使下游抗氧化因子产生，通过抗氧化作用干预DKD，因此进一步研究此通路激动剂对于防治DKD至关重要，故今后需积极寻找具有促进Keap1-Nrf2解离、促进Nrf2入核、促进转录等作用的激动剂，以激活Keap1-Nrf2-ARE通路，为临床防治DKD药物的发掘提供方向。