邻近标记技术APEX2的发展与应用

罗思，丁明

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 211198）

研究活细胞细胞器和亚细胞区域的蛋白质组有助于理解细胞中组织和蛋白质相互作用网络，因此兴起了许多方法。基于邻近标记的方法结合质谱（MS）的蛋白质组的系统分析为研究蛋白质的相互作用提供了一种高通量的方法。近年来，研究蛋白质相互作用的邻近依赖标记技术也取得了很大发展。目前用于邻近标记技术的酶主要有3种：辣根过氧化物酶（HRP）、邻近依赖的生物素鉴定（BioID）和工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）。虽然第一个基于生物素邻近标记的研究是利用HRP和芳基叠氮生物素做底物进行的[1]，但是HRP在哺乳动物细胞质中并不活跃。在细胞质的还原环境中，HRP的4个二硫键和2个Ca2+离子结合位点会被破坏，不能稳定维持自身结构[2]。这一缺陷限制了其在细胞内相互作用方面的使用，因此HRP逐渐退出蛋白质相互作用研究的舞台。基于BioID的邻近标记采用了来自大肠杆菌的生物素连接酶BirA的突变形式，利用质谱检测BirA修饰生物素化蛋白，可以鉴定出与感兴趣蛋白相互作用的微弱或者短暂的蛋白质，目前这种技术已成功用于天然环境中相互作用伙伴的生化筛选[3-5]。然而在BirA标记过程中，BirA的产物——生物素-腺苷酸酯的半衰期长达数分钟，以至于它导致的标记半径偏大，得到的结果假阳性偏多。此外BirA标记的速度很慢，通常需要18～24 h，因此很难研究高度动态的蛋白质相互作用。因此BioID技术不能很好地运用于亚细胞结构中蛋白质相互作用，为了提高空间和时间的特异性，APEX2技术则被开发出来[6-7]。随着APEX2技术的不断拓展，越来越多的科学家开始利用APEX2技术来解决一些以前难以研究的问题，例如亚细胞器中蛋白质的定位与分析、某些存在争论的蛋白质的结构以及动态蛋白质复合物的识别与鉴定等。本文主要对APXE2技术进行总结与归纳，阐述其作用原理及APXE2技术在不同类型的相互作用的蛋白质组的应用。

1 APEX2技术的策略

1.1 工程抗坏血酸过氧化物酶（APXE2）

抗坏血酸过氧化物酶（APX）是一种I类胞质植物过氧化物酶，与HRP不同，由于缺乏二硫键和钙离子，所以能够在还原环境中保持天然的活性[8]。野生型的APX并未在哺乳动物细胞中进行测试，并且其天然底物抗坏血酸盐的结构与二氨基联苯胺（DAB）基本不相同，加上APE是同型二聚体，严重影响蛋白质的天然定位和功能[9-10]，导致APE的适用性不大。随后MARTELL等[11]在APE基础上进行改造，最终得到一种名为APEX的单体抗坏血酸过氧化物酶；相对于APE而言，APEX不仅缺乏二硫键和钙结合位点，可以在还原性的胞质环境中表达而不失去活性，并且其活性得到很大改善。经过改造过后的APEX，可以用于电子显微镜（EM）的细胞内特异性蛋白质成像[11]和空间分辨蛋白质组学定位成像[6-7]。然而APEX在使用过程中有一个很大缺陷——低灵敏度。当APEX表达量低时，其功能受到很大的局限性。因此LAM等[12]通过酵母展示和定向进化技术，在APXE的基础上进行随机突变，最终得到一种A134P的突变体，并命名为APEX2。它相对于APEX而言，具有相同的化学性质，但是其催化活性和表达量得到很大改善。由于APEX2标记过程产生的生物素-苯氧基自由基是短寿命的（＜1 ms），能够产生一个较小的标记半径（＜20nm），因此APEX2标记能够提供更高的空间和时间特异性。为了解决对依赖于相互作用的邻近标记工具的需求，HAN等[13]也在APEX2的基础上，对其进一步定向进化改造，得到了一种叫做分裂的APEX（sAPEX），sAPEX技术扩展了邻近标记的方法，具有更高的时空分辨率，将基于APEX方法的效用扩展到生物学的新领域。

1.2 APEX2的技术原理

APEX2技术原理可以分为两大方向：①APEX2能够在细胞内形成电子密度高的锇，然后通过EM进行结构的判断。活细胞可以在二氨基联苯胺（DAB）和双氧水（H2O2）的溶液中固定，APEX2可以催化DAB的聚合和局部沉积，随后吸收电子密度较高的锇，最后形成对比，最后用EM可视化APEX2的表达结构[11]。②APEX2能够在通过生物素化邻近蛋白质，从而进行蛋白质组学的分析。APEX2酶能够在H2O2的存在下，将生物素-苯酚（BP）氧化成极短寿命（＜1 ms）和高度活性的自由基，然后它们可以共价连接到在邻近的内源性蛋白质中的富含电子的侧链氨基酸残基上，从而对底物进行生物素标记[6，11]。通过去除H2O2和加上淬灭缓冲液，可以中止标记反应，然后可以利用链霉亲和素的珠子分离得到生物素化蛋白，并通过质谱进一步分析[6-7]。

2 APEX2技术的应用

2.1 在不同细胞器和亚细胞结构域中蛋白质组学的应用

细胞器蛋白质组和亚细胞结构域的表征对于理解细胞组织、识别蛋白质复合物以及蛋白质相互作用网络是必不可少的。APEX2技术介导的邻近标记最早是由RHEE及其同事发现，其目的是规避传统的线粒体纯化的局限性和实现细胞器蛋白质组定位的时空特异性[6]。由于生物素-苯氧基自由基不具有膜透性，APEX2技术非常适合用于膜封闭的亚细胞室的蛋白质组学分析，例如线粒体基质、内质网、自噬体等结构。线粒体由外膜（OMM）、内膜（IMM）以及线粒体基质组成。线粒体基质是IMM所包围的内部的亚细胞器区域，位于OMM和IMM之间的区域称为膜间空间（IMS）。为了检测APEX在蛋白质组学上的标记能力，RHEE等将线粒体基质靶向APEX用于人胚肾细胞（HEK），并结合双态SILAC标记和MS进行相对定量，最终495个蛋白被鉴定为线粒体基质蛋白，其中94%的蛋白质有线粒体注释，另外6%被认为是新的线粒体蛋白。此外一些先前被认为存在于IMS或OMM的蛋白质，包括原卟啉原氧化酶，被APEX技术得到的蛋白质组数据重新分配到线粒体基质的归属，并且通过电子显微镜证实。RHEE等的研究充分展示了APXE技术在面对基质的内膜蛋白和膜间空间（IMS）之间具有特别的特异性和区别。APEX介导的蛋白质组映射的特异性，结合其易用性，为生物学家了解活细胞的分子组成提供了一个强有力的工具。

随后HUNG等[7]通过对线粒体IMS的研究，进一步证实APEX技术能够实现空间和时间特异性蛋白质组的映射。此外APEX2也已经成功地应用于线粒体外膜和内质网外膜[14]和自噬体内腔[15]中蛋白质组的研究。APEX2技术除了应用于这几个膜细胞器的研究外，有科学家将APEX2技术也成功应用于细胞核中蛋白质组学的研究[16]。核层（NL）是位于内部核膜下的细胞核的一个亚结构。NL的主要结构成分是中间丝蛋白，分为A型和B型。TRAN等[17]通过将APEX2融合到NL-B1蛋白中，成功地识别出NL近端蛋白、RNA、DNA。APEX的应用并不局限于膜封闭的细胞器的分析，它已成功地用于分析非膜封闭的细胞器的蛋白质组，如原发性纤毛[18]。

除了成功利用APEX技术来分析细胞器蛋白质组学分析外，APEX还为鉴定相互作用的蛋白质提供了一个很好的工具。例如将APEX2与内质网上的Ca2+传感器STIM1融合，在活细胞中能够很好地映射内质网和细胞膜连接的蛋白质组，也鉴定出STIM激活的增强子TMEM110（STIMATE）[19]。BERSUKER等[20]也将APEX2应用于脂滴相互作用的蛋白质组学研究，这种方法不仅鉴定到许多之前验证过的脂滴蛋白，也揭示了新的脂滴蛋白，并且还能通过APEX2技术对脂滴动态蛋白质组学进行研究，揭示其调控机制。KE等[21]也是在APEX2的基础上，通过对修饰的酚羟基结构进行设计，得到了高标记特异性的生物素-苯酚类似物，也同样展示出APEX2技术能够很好地应用于在活细胞内相互作用蛋白质的分析。

2.2 在蛋白质拓扑结构鉴定中的应用

除鉴定相互作用蛋白外，APEX2技术同样具备强大的定位功能。Sigma-1受体（S1R）主要定位于内质网（ER），作为一个多能的细胞内信号分子，在细胞中有多种作用，包括离子通道调节、应激信号和转录调节，然而，这种蛋白质在细胞内的基本拓扑结构仍然存在争议。由于关于ER膜中S1R蛋白确切拓扑结构的报道相互矛盾，MAⅤYLUTOⅤ等[22]应用APEX2技术，在全长S1R蛋白的N端或者C端连上APXE2，再利用APEX2技术能够在细胞内形成电子密度高的锇，然后通过EM进行结构判断的原理，最终确定了全长S1R的N端面对细胞质，而C端面对内质网腔，成功地解决了Sigma-1受体N端和C端的拓扑结构的问题，展示出APXE2技术在争论的蛋白质的结构上的强大定位功能。

2.3 在RNAs蛋白相互作用分析中的应用

APEX2不仅可以研究蛋白质的相互作用，还可以应用于分析细胞内RNAs的空间环境和RNA蛋白相互作用。不同的核糖核蛋白复合物控制mRNA的加工、翻译和衰变。这些复合物中的转录本定位于细胞的特定区域，并可以凝结成非膜结合结构，如应激颗粒。然而，事实证明，绘制这些大型动态结构的RNA组成具有挑战性。2019年，PADRÓN等[23]利用APEX2技术，开发了一种名为APEX-seq的技术，解决了RNAs的定位问题，并且还鉴定出关键的RNAs结合蛋白。将空间转录组（如APEX-seq所揭示的）与空间蛋白质组（如APEX-质谱所确定的）进行匹配，精确地平行获得，为研究活性mRNA的翻译起始复合物的组织结构和应激颗粒组成提供了新的见解。APEX2技术允许一个强大的和通用的方法来探索大分子的空间环境。2020年，HAN等[24]也利用MS2-MCP系统和设计的CRISPR-Cas13系统将APEX2以高特异性靶向人端粒酶RNA hTR，在1 min的邻近生物素化过程中，捕获了hTR的候选结合伙伴，发现了12未鉴定过的hTR结合蛋白。MS2-和Cas13靶向的APEX2技术有助于发现活细胞中新的RNA蛋白相互作用。

2.4 在体内蛋白质组学中的应用

除了细胞水平外，APEX2技术也同样适用于体内研究。CHEN等[25]通过构建mito-APEX，成功地将APEX2技术用于表征活果蝇肌肉细胞中的线粒体基质蛋白质组，实现了APEX2在体内的研究。利用APEX2技术建立了活果蝇组织的蛋白质组定位平台，一旦激活，APEX2酶催化邻近内源性蛋白质的生物素化，然后可以被分离并被质谱鉴定。APEX2技术在果蝇不同亚细胞室的多个组织中具有有效的标记功能，并绘制了果蝇肌肉线粒体基质蛋白质组图，进一步证明APEX2技术在活细胞亚细胞蛋白质组表征方面的能力。

此外APEX2也已被进一步应用于酵母细胞，利用优化过的APEX2技术，HWANG等[26]在酵母细胞中鉴定出一个新的高尔基定位的蛋白酶Rbd2的结合蛋白——Cdc48，并表明该蛋白在Rbd2识别SREBP中的发挥作用。SINGER-KRÜGER等[27]也在酵母细胞中，通过APEX2技术结合细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC），很好地展示膜封闭和半开放室、线粒体基质和细胞核的蛋白质组图谱，并发现了一个全新的蛋白Yer156C。

3 总结

作为一种邻近标记技术，APEX2技术不仅可以实现蛋白质相互作用的鉴定，也实现了亚细胞结构中蛋白质组学定位以及瞬时、动态的蛋白质复合物的识别，使得APEX2技术被越来越多的人所接受。APEX2技术能追踪细胞内瞬时的、动态的分子间相互作用，更好地绘制分子间相互作用图谱，获得更为深入全面的生物学信息。相信在不久的将来，APEX2技术能够成为研究生命科学问题主流手段。