糖尿病视网膜病变的代谢组学研究进展

张露元 综述 李筱荣 审校

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心天津市分中心 天津市视网膜功能与疾病重点实验室 300384

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是由糖尿病引起的微血管并发症之一，可造成黄斑水肿、眼底出血、视网膜新生血管生成等眼底改变，晚期患者常出现牵拉性视网膜脱离等严重视网膜病变，甚至可致盲[1]。目前DR主要的治疗方法包括降血糖药物、激光光凝、玻璃体切割术及玻璃体内注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物等，但手术治疗仅能延缓疾病进展，并不能从根本上治疗DR，且玻璃体内反复注射增加眼内炎发生风险[2-3]。因此，目前亟需进一步探索DR的发病机制和新的治疗靶点。代谢组学分析可以提示细胞、组织或器官的生化状态，协助阐释新基因或功能未知基因的功能，并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性，有助于更系统地了解疾病的发生和发展过程，目前其已被广泛应用于糖耐量受损和糖尿病等代谢疾病的机制研究中。近年来，这项技术也逐渐应用于DR的研究。本文就DR相关模型鼠眼组织以及DR患者玻璃体液、房水、血浆样本代谢组学研究进行综述。

1 代谢组学

1.1 代谢组学的基本概念

代谢组是指生物或细胞在特定生理时期内所有低相对分子质量代谢产物，而代谢组学与基因组学和蛋白质组学研究思路相一致，是对生物体内所有低相对分子质量代谢产物进行定性、定量分析，进而寻找与生理病理变化相关代谢物以及代谢途径的研究方法，其研究对象是相对分子质量1 500以内的小分子物质。与基因组学和蛋白质组学相比，代谢组学是一个相对新的领域，可以揭示机体在正常和病理条件下对外界刺激做出反应的代谢信息，因此代谢组学与临床表型关系密切，其正逐渐成为医学研究的重要工具之一。代谢物是基因转录和翻译产物，可以提供机体在正常和病理条件下对外界刺激做出反应的信息，因此代谢组学与临床表型关系密切，具有极大的基础研究和临床应用潜力[4]。

1.2 代谢组学技术

代谢组学发展依赖于代谢组学技术的进步，目前国内外主要的代谢组学研究平台有核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、气相色谱串联质谱(gas chromatography-mass spectrum，GC-MS)、液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS)和毛细管电泳-串联质谱(capillary electrophoresis-mass spectrum，CE-MS)，利用各分析技术平台进行的代谢组学研究各有优劣[5]。NMR技术是一种快速、高效的非靶向分析技术，样本无需预处理，且数据库也较为全面、成熟，但无法检测低丰度的代谢物，灵敏度较低；GC-MS技术主要用于检测具有挥发性的样本，样本需要衍生化处理，从而延长了样本的制备时间，但衍生化扩展了代谢物检测的覆盖率，同时高色谱分辨率和灵敏度确保低丰度代谢物的分离检测；LC-MS技术根据样本的亲水性进行分离检测，检测灵敏度较高，但样本预处理可能导致其破坏，进而导致样本重现性差；CE-MS技术根据极化率和分子形状对样本进行分离检测，适合分析离子性代谢物，所需样品量小，但稳定性较差[6-7]。目前DR代谢组学主要以玻璃体液和血浆为研究对象，利用NMR、LC-MS或GC-MS等技术非靶向或靶向检测异常代谢物和代谢途径，挖掘可能的代谢生物标志物，为研究DR的发生和发展提供了新的思路。

2 代谢组学在DR中的应用

2.1 DR相关动物模型眼组织的代谢组学研究

DR代谢组学研究采用的动物模型主要有氧诱导性视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型、糖尿病小鼠模型和糖尿病大鼠模型。由于OIR小鼠模型具有与增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者类似的病理表现，如视网膜缺血、视网膜新生血管以及神经退行性病变等，以这些动物模型作为研究对象进行代谢组学研究具有一定的参考价值。Paris等[8]收集OIR模型小鼠造模第12、14和17天全眼球组织匀浆作为样本，采用高效液相色谱系统和MetaboAnalyst程序对样本中失调代谢物进行途径富集分析，发现样本中脯氨酸、精氨酸和赖氨酸水平从第14天开始升高；同时在PDR患者玻璃体液中也观察到精氨酸等氨基酸水平升高，推测精氨酸代谢在OIR模型小鼠眼球组织和PDR患者玻璃体液中均发生失调，精氨酸代谢途径异常与DR进展相关。Atawia等[9]研究发现，精氨酸酶基因敲除对高脂饮食导致的视网膜炎症具有抑制作用，进一步验证精氨酸代谢途径异常可能与DR进展过程中异常的氧化应激反应相关。此外，研究者通过代谢组学研究发现非肥胖糖尿病小鼠模型血浆和PDR患者玻璃体液中支链氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA)水平升高[10-11]。BCAA在DR中具体作用机制尚未阐明，但已有研究表明其合成抑制剂加巴喷丁可以显著降低糖尿病大鼠视网膜BCAA及其下游谷氨酸水平，进而改善大鼠视网膜氧化应激损伤[12]。目前仍没有可以完美模拟DR患者全部病理改变的动物模型，因此其代谢组学研究具有很大的局限性，其结果仅能对高血糖对眼部造成的影响或病理性新生血管潜在治疗靶点起到提示作用。

2.2 DR患者玻璃体液的代谢组学研究

玻璃体-视网膜界面在视网膜疾病中起重要作用，玻璃体新陈代谢与DR病理过程密切相关。利用代谢组学技术可以发现DR患者玻璃体液中异常富集的代谢途径，通过挖掘异常代谢物来推测过度激活的酶，为探索治疗靶点提供新的思路。Haines等[13]利用超高效LC-MS技术对25例孔源性视网膜脱离患者、9例PDR患者和8例视网膜前膜患者玻璃体样本进行对比分析，在PDR患者玻璃体液样本中观察到戊糖磷酸途径过度激活，该途径是维持谷胱甘肽稳定和补充抗氧化酶的还原性辅酶Ⅱ主要来源。Curovic等[14]利用LC-MS技术在DR患者血浆样本中也观察到了这种变化。以上DR代谢组学研究结果均表明在氧化应激条件下戊糖磷酸途径发生改变。另外，Haines等[13]研究还发现DR患者玻璃体液中嘌呤代谢加快，黄嘌呤水平降低，而黄嘌呤上游代谢物鸟嘌呤、次黄嘌呤和肌苷水平升高，推测黄嘌呤氧化酶表达上调，进而与下游产物尿酸共同作用，产生过量的过氧化氢，导致氧化应激反应发生。相反，一项OIR小鼠模型全眼匀浆标本代谢组学研究结果显示，黄嘌呤、次黄嘌呤和肌苷水平均降低[8]。分析出现这种结果的原因：一方面，可能因为2个研究中标本代谢物提取方法不同，导致从不同溶剂中回收代谢物含量出现差异；另一方面，OIR小鼠模型并不能完全模拟PDR患者眼部代谢失调，但其结果可以一定程度上提示DR患者视网膜缺氧导致的代谢改变。Wang等[11]利用气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOFMS)联用技术对DR患者和非糖尿病患者玻璃体样品进行对比分析，检测到DR患者玻璃体液中精氨酸-脯氨酸代谢途径中间环节产物鸟氨酸的水平显著增加。精氨酸在视网膜中可经一氧化氮合酶(nitric oxide synthases，NOS)催化生成一氧化氮(nitric oxide，NO)和瓜氨酸，或在精氨酸酶Ⅱ(arginase-Ⅱ，Arg-Ⅱ)作用下生成鸟氨酸和尿素[15]。糖尿病患者玻璃体液鸟氨酸水平升高表明视网膜组织中Arg-Ⅱ酶过度激活，进而导致NOS途径被竞争性抑制，NO生成减少，这可能是血管舒张功能受损的原因[8,11]，进而导致视网膜缺血、缺氧。因此，阻断Arg-Ⅱ酶可能是延缓DR进展的潜在治疗策略。Wang等[11]还检测到DR患者玻璃体液中L-亮氨酸和L-缬氨酸增加，提示BCAA合成途径上调。高BCAA水平被认为与视网膜中谷氨酸神经毒性增加有关，阻断突触后神经元的谷氨酸受体可以保护视网膜神经元功能和活性[12]。已有研究显示，钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂埃帕利氟嗪可以有效上调2型糖尿病患者BCAA分解代谢[16]。由此推测，埃帕利氟嗪可能对DR也有效。玻璃体液作为最靠近视网膜的眼内液，较易采集且可以很好地代表视网膜代谢情况，但其取材过程中感染风险较高，因此玻璃体液来源的DR生物标志物很难大范围应用于临床诊断；此外，部分PDR患者玻璃体腔中残留的血细胞成分也会对结果产生干扰，造成组学结果出现偏差。

2.3 DR患者房水的代谢组学研究

房水由睫状突上皮细胞产生，其主要循环途径是经后房、瞳孔、前房小梁网，最终汇入巩膜上腔静脉，其组成不仅取决于其产生过程，还取决于整个眼内不同组织的代谢状态。房水是眼内组织细胞代谢的直接场所，代谢产物更新较快，可以更好地反映糖尿病状态下眼内组织的代谢状态。Jin等[17]对糖尿病合并白内障患者、DR合并白内障患者和年龄相关性白内障患者房水进行基于NMR方法的代谢组学分析，结果表明DR患者房水中天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和苏氨酸水平高于糖尿病合并白内障患者。这些代谢产物参与的三羧酸循环受异柠檬酸脱氢酶和β-酮戊二酸脱氢酶调控，而这2种酶受高浓度腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)和还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)抑制[18]。有研究表明，DR患者视网膜中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)/NADH比值显著降低[19]，猜测这些氨基酸增加可能与DR患者体内高水平NADH抑制三羧酸循环有关[17]。此外，Jin等[17]研究还显示，DR合并年龄相关性白内障患者房水中二甲基精氨酸(dimethylarginine，DMA)水平高于糖尿病合并年龄相关性白内障患者。DMA是不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)主要代谢产物之一，ADMA通过竞争性抑制内源性NOS引起NO生成减少，进而导致血管内皮功能障碍[20]。曾有研究者发现DR患者血浆中ADMA水平升高[21]。虽然没有关于DMA和DR直接关联性的研究，但Jin等[17]研究认为DMA水平至少能部分反映DR患者视网膜氧化应激增强和内皮功能障碍状态。Wang等[11]在DR患者房水中检测到抗坏血酸水平降低。早期Sinclair等[22]研究发现，DR患者血清抗坏血酸水平显著降低。Haines等[13]在DR患者玻璃体液样本中也检测到抗坏血酸水平降低。抗坏血酸具有抑制肿瘤血管生成的作用[23]。因此，推测抗坏血酸可能参与DR血管生成过程。此外，Wang等[11]利用GC-TOFMS技术检测发现，DR患者房水中D-2,3-二羟丙酸、异柠檬酸和L-乳酸含量与空腹血糖和糖化血红蛋白水平均呈显著负相关，推测糖酵解或糖异生、半乳糖代谢和抗坏血酸-醛酸代谢可能是DR患者房水中3个显著干扰途径。与玻璃体液相比，房水样本取材感染风险较低，但其与视网膜组织距离较远，对视网膜代谢改变的代表性不如玻璃体液。但对于无法收取玻璃体液样本或玻璃体有积血的患者，房水中代谢组学研究结果仍可以提示视网膜代谢功能改变。

2.4 DR患者血浆的代谢组学研究

由于血液的取材相对简单且成熟，血浆和血清常作为代谢组学的研究对象[24]。Chen等[25]利用GC-MS方法对40例DR患者、40例未发生DR的糖尿病患者和40例非糖尿病者血浆样本进行研究，发现DR患者血浆中3,4-二羟基丁酸(dihydroxybutyric acid，DHBA)和2-脱氧核糖表达升高，而在未发生DR的糖尿病患者和非糖尿病者血浆中未发现此变化，推测这些代谢产物可能是DR区别于糖尿病的生物标志物。目前已知3,4-DHBA是琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症的尿液生物标志物，2-脱氧核糖是DNA氧化损伤所形成的产物。Curovic等[14]对1型糖尿病个体人群进行代谢组学研究也发现，血浆较高水平3,4-DHBA是DR进展的生物标志物。Sumarriva等[26]通过非靶向LC-MS技术发现，血浆中高肉碱水平与PDR发生相关。3,4-DHBA和肉碱均参与肠道微生物群落的代谢，而肠道微生物群落的代谢改变参与了肥胖和糖尿病的发展[27-28]。肠道微生物群落代谢与DR发生和发展过程的联系仍需进一步探讨。

Lin等[29]通过NMR技术检测发现，2型糖尿病患者血浆样本中BCAA、芳香族氨基酸和生糖氨基酸含量与糖尿病患者微血管并发症风险均呈正相关。然而Curovic等[14]在1型糖尿病患者的血浆中未发现这些氨基酸水平出现显著改变，该研究认为这可能是1型和2型糖尿病的异质性。Zhu等[30]利用LC-MS技术对PDR患者血清进行代谢组学分析，发现PDR患者血清中富马酸水平异常升高。已有研究表明，富马酸与肿瘤细胞诱导慢性缺氧环境有关[31]。由于持续高血糖状态往往导致视网膜局部缺氧，因此，推测富马酸可能参与了DR的发生和发展。然而，Haines等[13]在PDR患者玻璃体液中检测到富马酸下调，血浆和玻璃体的代谢产物存在差异性可能与血-眼屏障相关，富马酸在DR中的作用仍有待进一步研究。血浆较易得，以其为样本的代谢组学研究更多是利用质谱技术寻找DR潜在生物标志物，探讨DR发生和发展的机制，但这些机制目前仍不十分明确，血液反映患者全身代谢变化，难以展示眼局部病变的代谢变化，且个体差异较大，导致结果重复性差，仍需更多的研究来验证这些结论。

3 小结与展望

目前，基因组学和蛋白质组学已广泛应用于DR发病机制、诊断以及预后研究中，相比于基因组学和蛋白质组学，代谢组学从基因、蛋白质改变的下游产物——代谢物层面对疾病进行探索，从更接近生物表型的角度反映DR进展过程中机体的病理改变。此外，随着代谢物通过对大分子DNA、RNA和蛋白质进行修饰来调节上游生物过程的功能被阐明，代谢组学成为探索DR病理机制的有力工具。

目前，DR代谢组学研究主要以人眼内液和血浆为样本，人眼内液取样具有侵入性，但对眼部代谢改变的表现更加直观；血浆取材易得，但其中代谢物质改变并不能和眼部病变完全一致，同时外周血中代谢物水平更易受环境因素影响，导致部分结果不能被重复[32]；DR相关的动物模型仅能模拟DR患者部分病理改变，其代谢组学研究结果需在DR患者样本中进行验证。相信随着医学和实验技术的进步，会有更多与DR相关的代谢物被发现，同时在大量样本中验证异常代谢物和代谢通路，从而提高数据的可靠性，使代谢组学具有更大的研究和应用潜力。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

志谢感谢天津医科大学眼科医院张慧对本综述的贡献