间充质干细胞源性外泌体在肺动脉高压治疗中的应用

陈垚鑫， 邓芝花， 钱进先

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension， PAH)是由多种已知或未知原因致肺血管重塑而引起的肺动脉压异常升高的一种病理生理状态，主要表现为血管内皮完整性的丧失和细胞外基质的积累，包括胶原蛋白沉积、血管平滑肌细胞的增殖和肥大，导致动脉中层肥厚、向心或偏心性内膜增生和血管肌肉化，进而导致肺动脉进行性闭塞、肺动脉压力持续升高，甚至发展为右心室功能障碍[1-2]。目前临床治疗药物(包括前列环素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶5抑制剂等)主要是通过选择性舒张肺动脉，降低肺动脉压力，从而改善其临床症状，但是在改善肺血管重塑方面的作用有限，PAH患者一年病死率仍高达15%。一些研究[3]已经证实，间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一种不断自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潜能的细胞，能够有效地降低PAH中的肺动脉压力，改善右心功能。然而，MSCs不稳定且定向分化能力较差，因此推测其主要通过旁分泌方式分泌生物因子发挥治疗作用。外泌体则是MSCs与靶细胞间通讯交流的一种介质。本文就MSCs源性外泌体的生物学特征，以及其在PAH中的作用及其潜在作用机制作一综述。

1 MSCs与外泌体

1.1MSCs的作用 MSCs是一种能不断自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潜能的细胞。一方面，其干细胞的特性赋予其多种生物功能，如分化为各谱系细胞进而修复组织损伤、促进组织再生，调节炎症及免疫系统等[1]；另一方面，MSCs是最容易获取的干细胞，可以从骨髓、脂肪组织及脐带血等多种途径提取，因此，MSCs在各种疾病研究领域中被广泛应用[4-5]。然而，MSCs不稳定，直接使用干细胞有潜在的免疫排斥或染色体变异及致瘤等可能[6]，且其定向至受损组织发挥作用的方式容易受多种环境的因素影响，作用效率不高，有很大的局限性。经过大量研究[5]证实，MSCs培养上清或其成分可以介导MSCs的一些生物功能，它主要以旁分泌方式分泌生物因子去发挥作用的。

1.2外泌体的生物学特征

外泌体(Exosome， Exo)在20世纪80年代首次被发现，被定义为由脂质双分子层组成的具有“碟状”形态的微小小泡，属于细胞外囊泡的一种。细胞外囊泡是由多种细胞分泌的纳米级囊泡，根据囊泡的大小和形成方式，分为外泌体(30～150 nm)及微囊泡(50～1000 nm)、微粒或凋亡小体(50～5000 nm)[7]。它们功能相似，在形成过程中携带母体细胞的脂质、蛋白质及核酸等分子，在细胞间的信息交流过程中起到了重要作用。不同的是微囊泡等是细胞质膜受刺激后直接脱落而成，而外泌体的形成是细胞膜内部出芽，逐渐形成多囊泡(MVB)和腔内囊泡(ILV)后通过胞吐作用释放的。外泌体几乎可以由所有细胞类型释放，并可存在于血液、尿液和母乳等体液中[5,7]。

外泌体最初被认为是清除机体代谢废物的“垃圾车”，通过不断的探索，目前更多观点[7]认为，其是细胞间信息交流的关键，在此过程中发挥着不可替代的作用。主要有以下几方面的原因：第一，外泌体形成方式使其具有低免疫原性及可运输性等，这些特性使得外泌体成为良好的细胞间信息交流的介质；第二，外泌体作用方式广泛，可以通过受体配体相结合，以及与受体细胞胞膜直接结合或相互融合的方式，调节受体细胞，从而起到传递生物信息的作用[5, 7-8]；第三，不同来源的外泌体可以携带其来源的生物信息分子参与不同的生理或病理过程，还可以直接影响受体细胞的基因表达及细胞表型，从而调节受体细胞的生物学功能，发挥相应作用[7, 9]。

2 MSCs、外泌体对PAH的治疗作用及机制

MSCs功能机制及外泌体的应用均是当前各种疾病的研究热点。MSCs来源的外泌体(MSCs-Exo)具有MSCs相似的生物功能，它们在各种疾病模型中被广泛研究。Jason等[1]通过建立野百合碱诱导的肺动脉高压小鼠模型证明，胞外囊泡发挥治疗作用主要是通过外泌体实现的，静脉注射MSCs-Exo可以抑制低氧诱导的PAH的血管重建，但是给予去除外泌体的MSCs培养上清和成纤维细胞来源的外泌体并没有此作用[10]。许多研究[11]表明，MSCs-Exo对改善PAH是有作用的，主要体现在以下几个方面：改善心肺血流动力学、改善血管重塑、减缓右心室肥厚及右心衰竭的程度等。这几个方面的作用并不是独立体现的，这其中的关键点是改善肺血管的重塑，缓解肺动脉压力的升高，从而改善右心病理改变及相应的临床症状。

2.1MSCs-Exo抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的异常增殖

PASMC的异常过度增殖是PAH肺血管重建病理过程中的关键，已有研究表明，MSCs-Exo可通过抑制该过程发挥治疗作用。

一方面，外泌体可作为细胞间物质传递载体直接影响受体细胞基因表达，因此，MSCs-Exo调控PASMC增殖过程中的基因表达是常见的作用机制。Zhang等[11]研究表明，人脐带血MSCs来源的外泌体可通过Wnt非典型信号通路下调细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达，干扰细胞增殖周期，从而抑制PASMC的过度增殖。另一方面，有研究[12-13]表明，PASMC在受到环境等刺激时会发生细胞表型转换，这可能是导致肺血管重塑的原因之一。相应的研究[11]表明，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)信号通路可能诱发PASMC的增殖表型，给予MSCs-Exo可观察到PASMC的增殖受到抑制，同样也观察到了GSK3β的表达下降。因此，MSCs-Exo可以通过调节PASMC表型转换，从而在改善血管重建方面发挥部分作用。

2.2MSCs-Exo抑制肺血管内皮细胞(PAEC)凋亡、迁移

越来越多的证据表明，PAEC的功能失调是PAH发生、发展的又一重要事件，血管内皮的完整性是血流动力学稳定的关键，在缺氧、炎症、氧化应激等刺激下，PAEC损伤凋亡的影响是多方面的(包括肺血管张力、炎症、凝血、代谢和重构)。同时，PAEC释放的旁分泌因子也可能调节PASMC的存活、增殖及其功能表型，导致PASMC不受控制的增殖，并最终导致肺血管重构[14]，还有研究[15]表明，PAEC释放的外泌体可作为载体将翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein， TCTP)从内皮细胞转移到PASMC，从而促进PASMC的增殖和凋亡抵抗。另外，内皮-间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是一个内皮细胞逐渐将其内皮表型转变为间充质或肌成纤维细胞表型的生物学过程，在此过程中，细胞间黏附相关蛋白及表型丢失，并且获得迁移能力，向组织内部迁移导致血管内膜增厚，血管闭塞[16]。

研究[11]表明，MSCs-exo对缺氧诱导的PAEC损伤具有保护作用：一方面，MSCs-exo对缺氧诱导的PAEC凋亡和EndoMT具有抑制作用，细胞内抗凋亡基因上调，促凋亡基因受到抑制，抑制PAEC的间充质转化，从而提高内皮细胞的存活率；另一方面，MSCs-exo提高了PAEC血管生成能力、促进细胞黏附和收缩，均有利于肺动脉血管重塑的改善。

2.3MSCs-exo调控细胞的炎症激活途径

炎症反应的激活可以导致内皮细胞的凋亡、PASWC的增殖及免疫炎性细胞的聚集，引起肺血管重构和PAH的形成。多项研究表明，外泌体可以通过抑制炎症激活途径，减轻肺部炎症反应，缓解肺血管重塑。

在野百合碱诱导的PAH模型中，MSCs源性外泌体使抗炎、抗增殖的miRNA表达明显增加(如miR-34a、miR-122、miR-124和miR-127)，从而降低了右心肥厚指数[1]。研究[10]表明，信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是多种细胞因子和生长因子信号通路中所必需的转录因子，在低氧性PAH小鼠中，它与肺血管细胞的炎性水平及高增殖表型等相关。MSCs-exo可通过抑制STAT3信号通路，降低了白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(chemoattractant protein-1, MCP-1)等促炎性因子水平，抑制炎症及缺氧相关信号通路的激活，从而改善PAH。James等[4]从免疫调节角度证明了血管重塑的改善与减少巨噬细胞招募到肺组织、减少巨噬细胞促炎性细胞因子的表达、巨噬细胞的经典炎症激活途径转变为了抗炎激活途径有关。这些研究[2]表明，MSCs源性外泌体对PAH炎症激活途径具有广泛的调节作用，可能是治疗PAH的一种有效的新疗法。

2.4MSCs-Exo调控细胞的代谢途径

代谢紊乱是PAH的重要特征之一，PAH能使右心室及肺血管的病理改变过程中所涉及很多代谢相关生物分子水平改变[17-18]。Weiling等[19]总结了与PAH病理变化相关的7种主要代谢途径(包括葡萄糖和脂肪酸氧化、谷氨酰胺分解、精氨酸代谢、一碳代谢、氧化还原反应、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环和电子传递链。同时也表明，线粒体是生物合成途径和细胞信号传导过程中介导代谢途径的主要细胞器。缺氧可引起线粒体功能障碍，一方面线粒体功能障碍后继发胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受，具体表现为糖酵解的增加、葡萄糖氧化磷酸化的减少，为PAH过程中异常增殖的细胞持续提供能量和生物分子原料，在PAH发生、发展过程中扮演着重要的作用，这种代谢方式被称作有氧糖酵解，亦称作“华宝效应”[20-21]。另一方面，线粒体参与的稳态氧感应系统(homeostatic oxygensensing system, HOSS)是体内感知生理范围内气道氧水平和动脉氧分压微小变化的特殊组织构成的，当环境氧水平或体内氧分压水平有变化时，线粒体内的传感器改变活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，ROS被线粒体超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)局部快速转化为过氧化氢，过氧化氢从线粒体扩散到细胞膜，调节离子通道和酶，激活缺氧诱导因子1α，从而扰乱线粒体代谢和动力学，加速细胞增殖和抑制细胞凋亡[22]。研究表明，MSCs-Exo可以改善PAH缺氧暴露后的葡萄糖代谢转变和线粒体功能。MSCs-Exo可以增加丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)和谷氨酸脱氢酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1)的表达，GLUD1将谷氨酸转化为TCA循环代谢物α-酮戊二酸、PDH将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，均将糖酵解连接到TCA循环中，提高氧化磷酸化水平，改善线粒体功能，从而降低了细胞凋亡和坏死[23]。

PAH的病理变化主要有肺血管的重塑、炎性途径的激活及血管的闭塞等，表现为肺血管细胞的过度增殖和凋亡、胶原蛋白的沉积等[2, 10]。目前对PAH的治疗方法有限，大量研究已表明，MSCs来源的外泌体可以预防甚至逆转PAH的进展，从而为PAH治疗提供了一种新的选择。但是，MSCs源性外泌体在PAH治疗中仍存在一些不足，一方面，MSCs来源的外泌体包含的物质种类颇多(包括蛋白质、核酸等生物大分子)，参与调节PAH的关键性分子及通路机制尚不明确；另一方面，适用于临床治疗的靶点及疗效评估的标志物尚不清楚。因此，这也是未来需要进一步探索的方向。