血清Sema4C在结直肠癌患者的差异表达及临床意义

朱萍，浦春，胡蝶，张艳珍，张博超，杨艺凡，吴欣怡，陈银银，路勇，张秦

(1. 皖南医学院第一附属医院检验科，安徽 芜湖 241001；2. 皖南医学院检验学院，安徽 芜湖 241002)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，男性和女性癌症相关死亡率较高[1]。引起CRC的危险因素有很多，包括病毒和细菌感染、酒精、烟草、烟雾、衰老、溃疡性结肠炎以及基因突变[2]。癌细胞的侵袭和转移是包括CRC在内多数恶性肿瘤的基本生物学特征，也是患者治疗失败和致死的主要因素[3]。由于CRC早期症状隐匿以及早期发现和筛查的局限性，多数患者就诊时已处于中晚期，手术治疗或放化疗效果欠佳，预后不良[4]。因此在外周血中寻找一个高灵敏度及特异度的新型肿瘤标志物对于CRC的早期筛查诊断具有重要的临床意义。信号蛋白是一种可以调节宿主细胞功能，同时能介导癌症的许多特征，包括细胞生长、血管生成、逃逸等的蛋白家族[5]。脑信号蛋白4C(semaphorin 4C，Sema4C)是信号蛋白家庭成员之一，最初是作为参与神经系统发育和轴突导向的分子被发现。目前越来越多的研究证明，该分子不仅在神经系统的发育中起着有重要作用，在肿瘤中同样起着至关重要的作用。有研究证明其是治疗浸润性乳腺癌[6]、肝细胞性肝癌[7]和宫颈癌[8]的潜在靶点。然而，有关血清中Sema4C水平在CRC患者中的研究较少。本研究通过UALCAN数据库分析Sema4C在CRC组织及正常组织中的表达水平，通过观察CRC患者血清Sema4C表达情况，分析血清Sema4C水平与CRC患者临床病理特征间的关系，探讨其诊断CRC的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年12月—2021年4月在皖南医学院第一附属医院进行治疗的38例CRC患者血清为CRC组，同时收集37例健康体检者的血清作为对照组，血清立即保存至-80 ℃。CRC组年龄≥60岁患者33例，<60岁5例；男性23例，女性15例；肿瘤最大径≥3 cm 33例，<3 cm 5例；直肠腺癌21例，结肠腺癌17例；有神经侵袭11例，无神经侵袭27例；有脉管侵袭7例，无脉管侵袭31例；有淋巴结转移12例，无淋巴结转移26例；T1+T2的6例，T3+T4的32例。对照组年龄≥60岁患者4例，<60岁33例；男性23例，女性14例；CRC组和对照组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。CRC的诊断以病理学诊断为金标准，所有患者术前均未接受放疗、化疗及免疫制剂等抗癌治疗。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集CRC患者及健康体检者空腹静脉血5 mL(CRC患者于手术前采集，体检健康者于体检时采集)，置于含促凝胶剂的真空采血管中，室温下静置，1000 r/min离心15 min，取上清液置于EP管中，-80°冰箱保存。

1.2.2血清Sema4C水平检测 应用Sema4C ELISA试剂盒[艾莱萨生物科技(上海)有限公司]。检测严格按照说明书进行操作，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔和样本孔各加不同浓度的标准品50 μL，空白孔不加。将100 μL的辣根过氧化物酶偶联试剂加入标准孔和除空白孔外的样品孔中，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴箱孵育60 min。将反应板每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复清洗4次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μL终止液，15 min内，应用酶标分析仪(美国Bio-rad公司)在450 nm波长处测量样本吸光度。以所测标准品的吸光度为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样本吸光度值代入方程，计算出样本的浓度。

1.2.3临床资料收集 记录收集CRC患者年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤部位、神经及脉管侵犯、淋巴结转移和T分期等临床病理资料，分析血清Sema4C水平与患者临床病理特征之间的关系。

1.3统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件进行分析，数据为非正态分布，计量资料采用M(P25～P75)，两组比较采用Mann-WhitneyU检验；绘制ROC曲线，评估血清Sema4C水平对CRC的诊断效能；以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Sema4C在CRC患者中高表达 本研究通过UALCAN数据库对41例正常者和286例CRC患者进行Sema4C表达水平分析，发现Sema4C在CRC中的表达水平显著升高(P< 0.05)，见图1。

图1 UALCAN数据库中Sema4C在CRC患者及正常者中的表达水平

2.2CRC组与健康体检组血清Sema4c水平比较 应用Sema4C ELISA试剂盒检测CRC组与健康体检组血清，结果显示CRC组血清Sema4C水平[1.510(0.814～3.452) ng/mL]高于健康体检组[0.993(0.677～1.995) ng/mL]血清Sema4C水平，差异有统计学意义(Z=2.194，P<0.05)。提示Sema4C的高水平表达可能与CRC的发生有关。

2.3CRC患者血清Sema4C与临床病理特征之间的关系 将血清Sema4C水平相对表达水平与CRC患者性别、年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移、深部转移状态、有无神经侵犯、有无脉管侵犯等临床病理特征进行统计分析，结果发现血清Sema4C相对表达水平在肿瘤最大径、有无神经侵犯、T分期之间差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同年龄、性别、肿瘤部位、有无脉管侵犯及淋巴结转移患者之间差异均无统计学意义(P>0.05)，提示血清Sema4C水平与CRC的肿瘤大小、T分期及神经浸润有关。见表1。

表1 CRC患者血清Sema4C水平与临床病理特征之间的关系 单位：ng/mL

2.4血清Sema4C水平对CRC诊断效能 绘制ROC曲线评估Sema4C对CRC的诊断效能，结果表明Sema4C的ROC曲线下面积(AUC)为0.674(95%CI：0.523～0.771)(P=0.028)，当最佳截断值为1.257时，其诊断CRC的灵敏度为60.50%，特异度为70.30%。见图2。

图2 血清Sema4C水平对CRC诊断价值的ROC曲线图

3 讨论

Semaphorins家族蛋白(Sema家族)是一大类具有保守Sema结构域的信号蛋白，构成了膜结合和分泌蛋白的大家族，最初是作为调节神经系统生长发育，影响轴突的分支和突触形成被发现，后来被证明是许多生物过程中的关键调节因子，包括血管发育和癌症。该家族共有二十几个成员，根据结构和生物起源不同，这些分子被分为8个亚家族(Ⅰ～Ⅷ)[9]。Semas通过与两个主要受体家族，神经吡啶和神经丛素家族的受体结合来转导信号。这些与原代信号蛋白形成复合物的受体也经常参与其他信号蛋白信号传导。最近的证据表明，信号蛋白在多种癌症的病因中也起着重要作用，已经发现一些信号蛋白可以作为真正的肿瘤抑制因子，并通过各种机制抑制肿瘤进展，而其他信号蛋白则作为肿瘤进展的诱导剂和启动子，具体取决于特定的翻译后修饰[10]。已有的文献提出肿瘤相关炎性细胞(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)和癌症相关成纤维细胞(CAF)在调节癌症血管生成、侵袭和转移方面具有关键作用，在这些细胞中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)从抗肿瘤M1极化到M2替代激活表型的转变可以诱导肿瘤血管生成并支持肿瘤进展，Semas通过调节免疫系统并调节TAM的功能，有助于调节肿瘤血管生成。例如，Sema3B被认为是潜在的肿瘤抑制因子，在许多癌症中具有下调作用，但它可以诱导癌细胞中IL-8的产生，有助于TAMs的募集，从而维持肿瘤血管生成和进展及促进转移形成[11-12]。

GU C H[12]提出Sema3A在内皮细胞中表达，并通过抑制整合素功能以自分泌方式调节内皮细胞迁移和血管重塑。此外，有研究表明，小鼠Sema3A的遗传缺失导致严重的肾脏血管模式缺陷，进一步支持Sema3A在血管生成重塑中的作用。而Sema4D其在多种肿瘤中的表达水平均较高，Sema4D可以通过结合PlexinB2刺激肿瘤内血管新生。同时Sema4D与Plexin-B1的结合也增强了Met磷酸化反过来进一步诱导肿瘤血管生成、侵袭和转移，加剧肿瘤细胞的恶性生物学行为，已被描述为血管生成的启动子和肿瘤进展的启动子。因此，这种信号蛋白被认为是开发新型癌症治疗药物的靶标[13]。而Sema4C与Sema4D结构同源性较高，功能相似。人Sema4C已被报道其在多种肿瘤中异常表达，并通过多种信号转导途径参与肿瘤的生长、转移和凋亡过程从而影响肿瘤的发生进展[5]。HUANG S Y等[14]通过对收集的74例上皮性卵巢癌、20例卵巢上皮良性肿瘤、20例卵巢边缘上皮肿瘤和15例正常卵巢组织进行检测并将Sema4C表达与患者临床病理特征做相关性分析，分析结果显示Sema4C mRNA在所有癌症组织中均有高表达，其表达水平与组织学类型无关，但Sema4C蛋白在上皮性卵巢癌中高度表达。并且Sema4C mRNA在上皮性卵巢癌中的表达与肿瘤分化程度、临床分期及腹水相关，而Sema4C蛋白表达与上皮性卵巢癌的分化和临床分期有关，但与组织学类型、腹水和年龄无关。Sema4C还被证明在肝癌中上调，并调节肝癌细胞的侵袭和迁移[15]。此外，有研究报道Sema4C在CRC组织中呈高表达，其表达情况与CRC患者的病理分期和肿瘤转移有一定的相关性，高Sema4C蛋白表达的CRC患者也表现出较差的总生存期和无进展生存期，提示高Sema4C表达可预测CRC患者的预后不良。该报道还指出Sema4C不仅可以通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路诱导上皮间质转化(EMT)，从而降低了细胞之间的黏附力，抑制细胞极性并增加肿瘤细胞的迁移能力，并且Sema4C表达与Sema4C基因中5’-UTR区域的甲基化呈负相关，而DNA甲基化等表观遗传变化在调节基因转录和CRC发展中起关键作用，异常的DNA甲基化可以通过灭活肿瘤抑制基因或激活癌基因来促进CRC进展[16]。WANG Y等[17]发现乳腺癌患者血清Sema4C水平显著高于良性乳腺癌患者和正常人员，且术后血清Sema4C水平显著低于治疗前水平。提示血清Sema4C水平可作为乳腺癌诊断特异性的生物标志物。

理想的血清学蛋白生物标志物应至少满足2个标准。首先，它应该是一种分泌的蛋白质，可以很容易地在血清中检测到。其次，它应该在癌症中特异性过表达，而不是在正常组织或良性病变中。最近的研究结果表明，Sema4C符合以下两个标准：它是一种分泌蛋白，在肿瘤中特异性过表达，在正常成人组织中几乎检测不到[17]。但关于血清中Sema4C的表达却少有人研究，本研究通过UALCAN数据库对41例正常者和286例CRC患者进行Sema4C表达水平分析，发现Sema4C在CRC中的表达水平显著升高。为了探究CRC与正常体检人员血清中Sema4C水平的关系，实验收集了CRC患者及健康体检者的血清检测发现在CRC患者中Sema4C的表达水平显著高于健康体检者。同时本研究收集了CRC患者的病理资料进行统计分析，结果显示，肿瘤最大直径≥3 cm者血清Sema4C水平高于肿瘤最大直径<3 cm者，CRCT3+T4者血清Sema4C水平高于T1+T2者，有神经侵犯者血清Sema4C水平高于无神经侵犯者，提升Sema4C可能参与CRC的发展过程，与CRC的肿瘤大小、T分期及神经浸润有关。有可能是由于Sema4C在调节癌细胞的增殖、神经发育和免疫细胞迁移中起重要作用[17-18]。研究结果显示，Sema4C在发育中的神经系统中广泛表达并且Sema4C可以特异性地与Plexin-B2结合，Plexin-B2受体在神经管闭合和小脑颗粒细胞发育中起关键作用，有研究报道Sema4C可能作为颗粒细胞到颗粒细胞的旁分泌因子，其和Plexin-B2结合后可以促进小脑颗粒细胞前体的迁移，并且当敲低Sema4C或抑制其受体Plexin-B2时，会导致癌细胞G2/M相变损伤、细胞分裂缺陷、生长停滞和细胞衰老，同时Plexin-B2也会损害Sema4C控制的小脑发育[18，20]。但Sema4C如何调节癌细胞运动仍不清楚。同时本研究结果显示，血清Sema4C诊断CRC的AUC为0.674，当最佳截断值取1.2570时，其诊断CRC的灵敏度为60.50%，特异度为70.30%。

尽管本实验结果提示CRC患者血清Sema4C蛋白水平高于肠道非肿瘤，血清Sema4C蛋白水平升高提示有发生深部转移及神经浸润的可能，其对CRC的诊断具有一定的价值。但将血清Sema4C蛋白水平作为CRC早期诊断的生物标志物仍然需要进行大样本深入研究，因为只有大样本量的前瞻性研究才能进一步阐明血清Sema4C作为CRC新型诊断生物标志物的临床价值。其次，血清Sema4C的ROC曲线下面积值较小，造成这一现象的原因可能与CRC的异质性、样本量的差异以及血细胞溶血等原因有关。因此，仍需要进行大规模多中心临床研究进一步来验证其有效性。