趋化因子CXCL7通过血管形成途径促进结直肠癌增殖、迁移及侵袭的机制研究

程刚 李东鹏 张华鹏 刘华 孙峰 梁海 李龙海

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球消化系统最常见的癌症之一，发病率和死亡率居前列［1］。2015年中国的一项调查报告显示，CRC 患者和死亡人数分别为37.63 万人和19.1 万人，其次是胃癌、肝癌和食道癌［2］。目前，CRC 的发病机制尚未完全阐明，主流观点认为与基因或表观遗传不稳定、饮食习惯、接触化学致癌物质、肿瘤血管生成等因素有关［3］。CXCL7 是一种中性粒细胞激活趋化因子，主要来源于外周血小板，其通常被认为与调节糖酵解、有丝分裂和前列腺素合成等有关。近年来国外研究报道了CXCL7 与CRC 患者预后相关，可作为CRC 的诊断生物标志物［4-5］，然而关于CXCL7 在CRC 的发生与发展中的作用机制却鲜有研究。本研究通过一系列实验来评估分泌性趋化因子对CRC 肿瘤微环境的影响，探究趋化因子CXCL7 对CRC 细胞增殖、转移及侵袭的影响与血管生成的关系，旨在阐明CXCL7 促进CRC发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞与试剂

人CRC 细胞系SW620（美国ATCC 公司）；NCM460 正常细胞株（美国ATCC 公司）；慢病毒载体LV5（EF-1aF/GFP&Puro）（苏州吉玛基因科技有限公司）；胎牛血清（批号1658396，Hyclone 公司）；人脐静脉内皮细胞（批号HUVEC001，澳赛尔斯生物技术有限公司）；Transwell 小室（康宁公司）；Matrigel 胶（美国BD 公司）；PBS（批号20140918，北京索莱宝科技有限公司）；细胞周期测定试剂盒（美国BD 公司）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；凋亡测定试剂盒（Beyotime 公司）；ECL 试剂盒（美国Millipore 公司）；ELISA 试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）

1.1.2 实验仪器与设备

酶标仪（VICTOR X5，美国Perkinelmer 公司）；BX53MRF-S 显微镜（日本Olympus 公司）；垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；CO2培养箱（型号MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司）；流式细胞仪（美国贝克曼公司）

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

取对数期生长的CRC 细胞在培养基中进行传代培养，并添加10%胎牛血清、100 μg/mL 的链霉素100 μL。所有细胞均置于饱和湿度、37℃的5%CO2培养箱中孵育。

1.2.2 CXCL7 稳转株的构建

通过qPCR 及ELISA 法检测CRC 细胞株的表达情况，挑选出高低表达细胞株，对高表达细胞株进行敲降（Knock down），低表达细胞株行过表达（Over expression）处理。克隆位点：NotI BamHI，借助慢病毒载体转染细胞株构建稳定过表达以及敲降细胞株。

1.2.3 CXCL7 对CRC 细胞增殖能力的影响

使用CCK-8、EdU 染色和平板克隆形成实验测定CXCL7 对CRC 细胞增殖能力的影响。

1.2.4 CXCL7 对CRC 细胞周期和凋亡作用

收集CXCL7 过表达及敲降的稳转株，PBS 洗涤，75%乙醇固定后，PBS 继续漂洗1～2 次，使用细胞周期测定试剂盒，流式细胞仪测定各管细胞周期分布情况。同样使用不含ETDA 的胰蛋白酶消化处理细胞，经固定与漂洗后，使用凋亡测定试剂盒，流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.2.5 Transwell 肿瘤细胞侵袭实验

Transwell 小室上层加入CXCL7+NC 组细胞，下层加入血清培养液，中间加入胶。4%多聚甲醛固定10 min，1%结晶紫染色30 mim，镜下观察并拍照，100 倍光镜下随机选取5 个视野进行计数，平均值作为计算结果并进行比较。

1.2.6 趋化因子CXCL7 对脐静脉内皮细胞血管形成实验

96 孔板放置于-20℃预冷，每孔以50 μL Matrigel 胶包被，置于37℃中孵育30 min，使胶凝固；胰酶消化对数生长期的脐静脉内皮细胞，用人LoVo 细胞培养上清液重悬后计数，细胞接种于Matrigel 胶包被的96 孔板，每孔接种100 μL 中细胞数4 000 个。培养板置于细胞培养箱中培养，6 h 后加入Calcein-AM/PBS 溶液，37℃避光孵育30 min，PBS 洗涤2 次，荧光显微镜下观察并拍照计数管腔形成数目。

1.2.7 血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（VEGF-R）表达水平测定

ELISA 试剂盒测量培养上清VEGF 水平，Western blot 检测血管内皮生长因子受体（VEGF-R）表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行统计学处理，计量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点吸光度值比较

48、72 h 各组吸光度比较：CXCL7 干扰组＞NC 组＞空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组不同时间点吸光度值比较（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

表1 各组不同时间点吸光度值比较（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与NC 组比较，bP＜0.05。

72 h 1.41±0.12ab 1.13±0.11a 1.01±0.13 17.475＜0.001组别CXCL7 干扰组NC 组空白对照组F 值P 值n6 6 6 0 h 0.25±0.02 0.24±0.01 0.25±0.01 1.000 0.391 24 h 0.34±0.02 0.32±0.02 0.31±0.03 2.471 0.118 48 h 0.82±0.10ab 0.69±0.08a 0.62±0.09 7.567 0.005

2.2 Transwell 细胞迁移实验

迁移细胞数比较：CXCL7 干扰组（1021.14±106.55）个＞空白对照组（348.36±48.64）个＞NC 组（331.98±46.81）个，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组Transwell 细胞迁移实验结果（1%结晶紫染色，×100）Figure 1 Transwell cell migration test results in each group（1% crystal violet stain，×100）

2.3 细胞侵袭实验

侵袭进入下室的细胞数比较：CXCL7 干扰组（103.21±15.33）个＞空白对照组（28.54±8.17 个＞NC组（24.65±8.36）个，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 脐静脉内皮细胞血管形成实验

处理CRC 细胞6 h 后，结果显示空白对照组和NC 组仅有少量小管形成，而CXCL7 干扰组却形成了大量网状结构的小管。管腔形成数目：CXCL7 干扰组＞NC 组＞空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2。

表2 各组管腔形成数目比较（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

表2 各组管腔形成数目比较（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与NC 组比较，bP＜0.05。

组别CXCL7 干扰组NC 组空白对照组F 值P 值n6 6 6管腔数（个）28.14±3.22ab 15.89±2.16a 4.47±1.10 155.272＜0.001

图2 各组脐静脉内皮细胞血管形成实验结果Figure 2 Experimental results of umbilical vein endothelial cells angiogenesis in each group

2.5 各组VEGF 水平及VEGF-R 阳性表达率比较

VEGF 水平及VEGF-R 阳性表达率：CXCL7 干扰组＞NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组VEGF 水平及VEGF-R 阳性表达率比较（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

表3 各组VEGF 水平及VEGF-R 阳性表达率比较（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

组别CXCL7 干扰组NC 组t/χ2值P 值VEGF（pg/mL）576.25±84.63 357.47±28.34 15.504＜0.001 VEGF-R 阳性表达率（%）90.0（36/40）67.5（27/40）6.050 0.014

3 讨论

近年来国内外大量研究发现，一些趋化因子在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及血管形成过程中发挥重要作用［6-7］。趋化因子是一种8～12 kDa的分泌蛋白，可以调节白细胞的迁移，并参与炎症或伤口组织的修复等生理和病理过程。根据N 末端附近保守半胱氨酸的位置，这些小蛋白可分为CXC-、CX3C-、CC- 和XCL 亚组趋化因子［8-9］。CXCL7 属于ELR+CXC 趋化因子，其功能与其受体CXCR2 结合，并通过将中性粒细胞聚集到血管损伤部位，影响机体免疫反应［10］。目前，CXCL7 已被证明是乳腺癌、肺癌等多种癌症中重要的肿瘤微环境调节剂，也是癌症诊断中的潜在生物标志物［11］。但关于CXCL7 在CRC 发生与发展中的作用机制研究较为少见。本研究拟在前期工作基础上，运用分子生物学手段及动物实验技术系统研究CXCL7 对结直肠癌肿瘤微环境的影响，以及对结直肠癌细胞增殖、转移及侵袭的影响，阐明CXCL7 促进结直肠癌发展的分子机制。本研究有望在趋化因子调节水平为CRC 的诊断及防治提供新的视角和理论依据，并为CRC 的靶向治疗和预后提供重要指导。

本研究发现，在细胞增殖实验中，细胞培养48 h后，CXCL7 干扰组吸光度明显高于NC 组与空白对照组，细胞增殖作用明显增强，Transwell 实验中CXCL7 干扰组迁移与侵袭细胞数均多于NC 组与空白对照组，说明CXCL7 具有协助细胞增殖、迁移与侵袭的作用。血管生成是一个重要的生理过程，在肿瘤的增殖、侵袭和转移中也起着关键作用。血管生成为肿瘤的发展提供了营养支持，并促进肿瘤的持续生长。近年来相关文献报道［12］，血管生成在CRC 复发和转移中起重要作用，许多蛋白质和信号分子与CRC 细胞中的血管生成有关，包括VEGF 和趋化因子。VEGF 在CRC 肿瘤中高表达并与不良预后相关。既往研究专注于CRC 患者血清中的CXCL7，及其在CRC 预后中的潜在应用，然而，CXCL7 和血管生成之间的关系鲜为研究。近年来，一些研究揭示了趋化因子在调节血管生成中的作用，如CCL19 通过下调CRC 细胞中VEGF-A的表达来抑制血管生成的能力［13］。因此，可将此类研究作为研究CXCL7 在CRC 患者血管生成中作用的基础进行参考。本研究结果说明趋化因子CXCL7 可增强小管形成能力，促进肿瘤血管形成。此外，通过选择VEGF 作为血管生成的标志物，发现CXCL7可增强CRC 细胞中VEGF 的表达。Du 等［14］报道，CXCL7通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路与肿瘤生长、侵袭、迁移和血管生成有关。AKT 信号通路存在于人的所有细胞中，参与细胞生长、凋亡、迁移等多种代谢过程［15］。CXCL7 还可以通过与肿瘤血管生成相关的Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路发挥其作用。CXCL7 可加速肿瘤转移通过调节VEGF-R 在CRC 中的表达。因此，CXCL7 可能是通过激活AKT 等信号通路参与CRC 的发生与发展。综上所述，趋化因子CXCL7 可调控肿瘤微环境，促进肿瘤血管形成，进而协助结直肠癌细胞的增殖、转移和侵袭。本研究下一阶段的研究任务主要是通过动物实验探究CXCL7 对裸鼠CRC 细胞成瘤能力的影响。