四甲基吡嗪对感染鸡白痢沙门菌肉鸡生产性能的影响及氧化应激机制研究

王恩玲，刘 宁，张飞可

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023；2.帝斯曼维生素(上海)有限公司，上海 201400；3.洛阳鑫泰农牧科技股份有限公司，河南 洛阳471400)

鸡白痢沙门菌(Salmonellapullorum)是家禽生产中一种常见的致病性革兰氏阴性菌，可感染各品种和各生长阶段的家禽，尤其是雏禽。鸡白痢沙门菌感染在世界各主要养禽国家均有发生，其临床症状主要表现为家禽精神萎靡并出现急性、传染性白色腹泻。此外，鸡白痢沙门菌感染可损害家禽肠道健康，引起免疫应激和氧化应激，进而降低家禽的生产性能和存活率[1-2]，严重危害着养禽业的健康发展。使用抗生素通常是防控鸡白痢沙门菌感染最常见、最有效的一种方法。但由于耐药菌的增加和药物残留等诸多问题，抗生素被逐步禁止在饲料中使用，目前我国农业部颁布的饲料“禁抗令”已正式生效。因此，寻找能够防控鸡白痢沙门菌感染的抗生素替代品具有重要意义。

四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)又名川芎嗪，它主要是从伞形科植物中川芎的根茎中提取出的一种活性成分，属于生物碱单体。体外研究发现TMP对致病性大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌等致病菌都有不同程度的抑制作用[3]。在鼠上的研究发现TMP具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗组织纤维化等功能[4]。在獭兔上的研究发现添加TMP可缓解李斯特菌感染所导致的免疫应激[5]。在肉鸡上的研究表明，TMP可改善胫骨血管生成和肝脏氧化还原状态，进而缓解其胫骨发育不良[6-7]。此外，肉鸡日粮中添加TMP可缓解艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染导致的氧化应激和炎症反应，并可抑制肠道中大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌等有害菌增殖，进而缓解肉鸡的肠道损伤和生产性能下降[8]。添加TMP还可抑制肉鸡肠道中鼠伤寒沙门菌增殖，缓解鼠伤寒沙门菌感染导致的肠道损伤和生产性能下降[9]。然而目前并不清楚TMP是否可以缓解鸡白痢沙门菌感染对肉仔鸡造成的负面影响。本试验通过研究TMP对鸡白痢沙门菌感染肉仔鸡的生产性能、氧化还原状态和PI3K/AKT通路的影响，探究TMP对感染鸡白痢沙门菌肉鸡生产性能的影响及氧化应激机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 鸡白痢沙门菌 (CVCC1792)菌株，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 四甲基吡嗪 (TMP，纯度≥99%)，购自济南德瑞丰环保化工有限公司。

1.1.3 其他实验材料 二胺氧化酶(DAO；EC 1.4.3.6；A088)、丙二醛(MDA；A003)、蛋白质碳基(PCO；A087)测试盒均购自南京建城生物工程研究所；实时荧光定量(RT-PCR)仪为ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System(美国应用生物系统公司)；RT-PCR试剂和引物购自宝生物工程(大连)有限公司；超低温冰箱(海尔集团)。

1.2 试验动物与试验设计

从当地孵化场购买健康状况良好的1日龄AA肉公雏600只，饲养在河南科技大学研究中心的一个环境控制设施中。采集泄殖腔棉拭子，检测有无鸡白痢沙门菌感染，从中选出体重相近的阴性个体480只，随机分为4组：对照组、感染组、抗生素组和TMP组。每组6个重复，每个重复20只鸡。试验期14 d。前5 d室温保持在32 ℃，后逐渐降至28 ℃。在试验前两天给予24 h/d的光照，随后提供18 h/d的光照。对照组、感染组、抗生素组和TMP组试鸡分别饲养在4个构造相同但互不相通的房间内，三层半阶梯笼养。对照组和感染组饲喂基础饲粮，其配方见表1。抗生素组和TMP组肉鸡于试验全程分别在基础饲粮中添加 40 mg/kg 盐酸恩诺沙星和150 mg/kg的TMP。5日龄时，感染组、抗生素组和TMP组每只鸡口腔灌服 1 mL(105CFU)鸡白痢沙门菌培养液，对照组灌服等量无菌株培养液。鸡群全程自由采食和饮水，各房间温度、湿度和光照控制一致，符合白羽肉鸡对环境的要求。

表1 基础日粮组成与营养水平(风干基础)

1.3 样品采集与检测

1.3.1 生产性能和死亡数 每天记录试验鸡采食量，并于1和14日龄以重复为单位称量空腹体重，计算累计增重、累计采食量和料重比。每天检查鸡群健康状态两次，及时挑出死鸡，记录死亡鸡数，并校正采食量和体增重。

1.3.2 氧化反应产物测定 7日龄和14日龄时，从每个重复随机选2只鸡(12只/处理组)用于心脏采血，于3 000 g、4 ℃条件下离心15 min分离得到血清。然后将鸡只屠宰，分离十二指肠，用磷酸盐缓冲盐将其冲洗，刮取黏膜后加入三倍体积磷酸盐缓冲液充分匀浆，于10000 g、4 ℃条件下离心30 min，取上清液备用。用比色法测定血清和十二指肠黏膜中二胺氧化酶活性及丙二醛和蛋白质碳基的含量。

1.3.3 PI3K/AKT表达水平测定 取肉仔鸡十二指肠中段组织，用DEPC水冲洗干净后将其储存在-80 ℃下，用于基因表达分析。通过寡聚(dT)纤维素柱层分析法进行mRNA分离纯化。以mRNA为模板，经反转录酶催化合成cDNA。参照试剂盒说明书，根据PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT2、AKT3、GAPDH基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，引物信息见表2。引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应体系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物1 μL，10×稀释后cDNA 4 μL。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。每个样品重复3次。以无菌水和无RT-RNA样品作为扩增对照。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量[10]。

表2 实时定量PCR引物

1.4 统计分析

试验结果以平均数±标准差表达，使用 SPSS 24.0 软件中 GLM 程序对试验数据进行单因素方差分析。方差均质时采用Tukey's-b法进行多重比较，方差异质时采用Tamhane's T2法进行多重比较，显著标准设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 生产性能的比较

由表3可知，与对照组相比，鸡白痢沙门菌感染显著降低了7 d和14 d肉仔鸡的累计增重和累计采食量(P<0.05)，显著提高了料重比和死亡率(P<0.05)。与感染组相比，添加四甲基吡嗪后，显著提高了7 d和14 d肉仔鸡累计增重和累计采食量(P<0.05)，显著降低了14 d肉仔鸡的料重比和死亡率(P<0.05)。与感染组相比，添加抗生素后，显著提高了7 d和14 d肉仔鸡累计增重和累计采食量(P<0.05)，显著降低了14 d肉仔鸡的料重比和死亡率(P<0.05)。添加四甲基吡嗪与抗生素相比，累计增重、累计采食量、料重比和死亡率均差异不显著(P>0.05)。

表3 试验各组肉仔鸡生产性能的比较

2.2 氧化反应产物含量的比较

由表4可知，与对照组相比，鸡白痢沙门菌感染显著提高了7 d、14 d肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中的二胺氧化酶活性以及丙二醛和蛋白羰基含量(P<0.05)。与感染组相比，添加四甲基吡嗪显著降低了7 d肉仔鸡十二指肠黏膜和14 d肉仔鸡血清中的二胺氧化酶活性以及丙二醛、蛋白羰基的含量(P<0.05)，显著降低了7 d肉仔鸡血清中二胺氧化酶活性和14 d肉仔鸡十二指肠中二胺氧化酶活性和丙二醛含量(P<0.05)。与感染组相比，添加抗生素显著降低了7 d、14 d肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中的二胺氧化酶活性以及丙二醛和蛋白羰基含量(P<0.05)。与抗生素组相比，TMP组7 d、14 d肉仔鸡十二指肠黏膜和14 d肉仔鸡血清中的二胺氧化酶活性、以及丙二醛和蛋白羰基的含量差异不显著，但7 d肉仔鸡血清中的丙二醛和蛋白羰基的含量显著提高(P<0.05)。

表4 试验各组肉仔鸡血清和十二指肠抗氧化指标的比较

2.3 十二指肠PI3K/AKT信号通路的比较

由表5可知，与对照组相比，鸡白痢沙门菌感染显著提高了7 d和14 d肉仔鸡的PI3K、PIK3C3、AKT1和AKT3的表达水平(P<0.05)。与感染组相比，TMP组显著降低了7 d肉仔鸡PI3K、PIK3C3、AKT1的表达水平(P<0.05)和14 d肉仔鸡PI3K、AKT1和AKT2的表达水平(P<0.05)。与感染组相比，抗生素组显著降低了7 d肉仔鸡PI3K、PIK3C3、AKT1的表达水平(P<0.05)和14 d肉仔鸡PI3K、AKT1和AKT3的表达水平(P<0.05)。与抗生素组相比，TMP组7 d、14 d肉仔鸡PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT3和7 d肉仔鸡AKT2的表达水平均差异不显著(P>0.05)，但TMP可以显著降低14 d肉仔鸡AKT2的表达水平。

表5 试验各组肉仔鸡十二指肠PI3K/AKT信号分子表达水平的比较

3 讨 论

3.1 四甲基吡嗪对鸡白痢沙门氏菌感染肉仔鸡生产性能的影响

鸡白痢沙门菌感染在家禽生产中常有发生，尤其是对雏鸡具有很高的易感性。本试验发现鸡白痢沙门菌感染显著降低了肉仔鸡7 d和14 d的累计增重和采食量，同时显著提高了料重比和死亡率。前人研究同样发现鸡白痢沙门菌感染可导致肉仔鸡的平均日增重和平均日采食量显著下降，料重比和死亡率显著增加[11-12]。使用抗生素通常是治疗或缓解鸡白痢沙门菌感染非常有效的一种手段，可明显缓解生产性能的下降，这在本试验的结果中也有所体现。但鉴于抗生素所带来的危害，目前已禁止在饲料中添加抗生素，因此亟需寻找能够治疗鸡白痢沙门菌感染的抗生素替代品。TMP具有抑菌和免疫调节等多种功效。研究表明，肉仔鸡日粮中添加适量TMP对死亡率没有影响，但可以显著提高平均日增重、平均日采食量和饲料利用效率，并缓解艾美尔球虫和产气荚膜梭菌等细菌感染导致的平均日增重、平均日采食量和饲料利用效率的下降[8-9]。本试验表明，添加TMP缓解了鸡白痢沙门菌感染肉仔鸡7 d和14 d累计增重和采食量的下降以及料重比的增加，同时缓解了14 d死亡率的增加。值得注意的是，使用TMP达到了与使用抗生素相当的效果，说明TMP可替代抗生素来缓解鸡白痢沙门菌感染导致的肉仔鸡生产性能下降。

3.2 四甲基吡嗪对鸡白痢沙门氏菌感染肉仔鸡氧化反应的影响

二胺氧化酶是肠黏膜中一种具有高度活性的细胞内酶，当肠道受损时，二胺氧化酶可被释放至血液中，导致血液中二胺氧化酶的活性增加[13]。因此，血清和肠黏膜中二胺氧化酶活性可有效反映肠道结构和功能的完整状态。丙二醛是一种反应性醛，能够导致细胞产生有毒应激，它是自由基诱发的脂质过氧化反应的主要终代谢产物。蛋白质羰基的形成是自由基攻击蛋白质和蛋白质氧化过程中发生酶促水解的结果[14]。蛋白质羰基化已被广泛用于衡量蛋白质氧化损伤和功能异常的重要指标[15]。因此，组织中丙二醛和蛋白质羰基的含量可作为体内氧化应激的生物标志物。研究表明沙门菌感染可诱导肉鸡氧化应激，降低抗氧化酶活性，增加组织中氧化产物如丙二醛的含量[16-17]。本试验中，鸡白痢沙门菌感染显著增加了肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中丙二醛和蛋白质羰基的含量，说明肉仔鸡体内氧化还原状态失衡，这种情况有利于病原菌的进一步感染，进而可能引起肠黏膜受损，导致血清二胺氧化酶活性增加。TMP具有良好的抗氧化功效，可抑制细胞内活性氧的生成，增加细胞超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性，减少细胞丙二醛和一氧化氮等氧化产物和炎性介质的含量[18]。试验表明，TMP给药可抑制红细胞自氧化和过氧化氢所致红细胞溶血，还可促进超氧化物歧化酶表达，提高抗氧化能力，减少丙二醛的生成，降低脂质过氧化损伤程度[19]。目前，关于TMP对肉鸡抗氧化能力影响的报道几乎没有。本试验发现，添加TMP显著降低了感染状态下肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中丙二醛和蛋白质羰基的含量以及二胺氧化酶活性，且达到了与使用抗生素相当的效果，说明TMP可替代抗生素来缓解鸡白痢沙门菌感染所导致的肉仔鸡氧化应激，缓解其对肠道结构和功能的破坏，进而有利于肉仔鸡生产性能的改善。

3.3 PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT信号通路是与细胞功能相关最为密切的通路之一，它可调控细胞的新陈代谢、增殖分化和存活等生命过程，此通路在机体多种疾病状况下均存在异常表达[20]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，它是由调节亚基和催化亚基所组成的一种异源二聚体[21]。根据蛋白结构和底物特性的不同，P13K家族可分为三类：I型、Ⅱ型、Ⅲ型，分别包括I型催化亚基(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG)、I型调节亚基(PIK3RI、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5和PIK3R6)、Ⅱ型P13K亚基(PIK3C2A、PIK3C2B和PIK3C2G)和Ⅲ型P13K亚基(PIK3R4和PIK3C3)[21].AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要包括 AKT1、AKT2、AKT3 三种亚型，AKT是PI3K 信号通路中的一种非常重要的下游效应分子[22]。PI3K被激活后，会在质膜上产生第二信使PIP3，后者与细胞内含有相应结构域的信号蛋白结合，促使AKT结构中的丝氨酸磷酸化，进而导致AKT活化。活化后的AKT再继续磷酸化其下游激酶和转录因子，最终调节细胞的功能[22]。研究发现，PI3K/AKT信号通路转导在细菌感染过程中也扮演重要角色[23-24]。PI3K/AKT信号通路的异常激活可能与机体氧化应激产生联系[25-26]。本试验中，肉仔鸡感染白痢沙门菌后，其十二指肠中PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT3表达量都显著上调，说明鸡白痢沙门菌感染激活了肉仔鸡肠道PI3K/AKT1或PI3K/AKT3通路，进而可能引起肠道氧化应激，导致十二指肠黏膜中丙二醛和蛋白质羰基含量增加。通过调节PI3K/AKT信号通路可缓解机体氧化应激[26]。研究发现，TMP处理可抑制MAPK和Akt信号分子的磷酸化，减少活性氧的生成，阻断核转录因子(NF-κB)从细胞质到细胞核的易位，从而缓解脂多糖诱导的细胞氧化损伤[27]。本试验发现,TMP和抗生素均显著下调了感染组肉仔鸡7 d十二指肠PI3K、PIK3C3和AKT1的表达量，此外，TMP显著下调了14 d十二指肠PI3K、AKT1和AKT2的表达量，而抗生素则显著下调了14 d十二指肠PI3K、AKT1和AKT3的表达量，这说明随着感染日龄的增加，TMP和抗生素对肠道PI3K/AKT信号通路的调节作用不尽一致，这有待进一步研究。TMP和抗生素均可能通过抑制PI3K/AKT1信号通路而缓解鸡白痢沙门菌感染导致的肉仔鸡氧化损伤。

4 结 论

日粮中添加适量TMP可有效替代抗生素缓解鸡白痢沙门菌感染导致的肉仔鸡氧化应激，进而缓解其生产性能下降。TMP对肉仔鸡氧化应激的缓解作用可能通过调节PI3K/AKT1信号通路实现。