孔 婧,李梦洋,权 鑫,齐富玲,靳宏宇,孙庆申*
(1.黑龙江大学生命科学学院,农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江省寒区植物基因与生物发酵重点实验室,哈尔滨 150080;2.黑龙江省普通高校微生物重点实验室,哈尔滨 150080;3.黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室,哈尔滨 150080)
传统发酵乳通常以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂对鲜奶发酵,所得产品含有丰富蛋白质、氨基酸、维生素以及矿物质,因其营养价值及独特风味品质备受欢迎[1]。益生菌与发酵剂联合发酵可在保持发酵乳良好风味基础上提高其功能性。因此,将传统发酵剂以外乳酸菌应用于发酵乳中,在保证发酵乳良好风味品质基础上,可与市售发酵剂协同作用,使发酵乳具有更多功能特性,进一步提高发酵乳贮藏品质[2]。
在提高发酵乳贮藏品质相关研究中,Makki等研究乳糖氧化酶作为生物防腐剂在乳制品中应用,发现乳糖氧化酶在有残留乳糖和低pH的乳制品中对常见腐败菌具有显著抑菌效果[3]。Belguesmia等从原料乳中分离出一株Lactobacillus harbinensisK.V9.3.1NP,验证该菌株离心上清液中有机酸对汉逊德巴利酵母、扩展青霉、娄地青霉等真菌抑菌性[4]。Delavenne等研究表明乳酸菌抑菌性是菌株代谢产生的肽、有机酸以及衍生物协同作用,在发酵乳中添加天然具有抑菌性能益生菌或其代谢产物是今后食品防腐、延长货架期新的研究方向[5]。
植物乳杆菌是可以产多种益生物质的乳酸菌,广泛应用于食品发酵。植物乳杆菌可通过代谢产生多种产物,如有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰、抗菌肽等抑制病原菌生长[6],分泌胞外的多糖发挥免疫调节、抗肿瘤等作用[7]。目前,植物乳杆菌已应用于酸奶、泡菜、发酵乳制品及其他发酵食品中,可提高食品风味,改善食品品质、延长食品保质期[8-9]。因此,具有益生功能性的植物乳杆菌在食品开发中备受关注。
乳制品(包括发酵乳制品如奶酪和酸奶)的生产环境、生产季节、市场上流通时间、冷藏能力不足等因素均导致酸奶污染,特别是真菌污染,安全性令人担忧[10]。利用植物乳杆菌产细菌素特性[11],将其投入鲜奶,与发酵剂联合作用,是解决上述问题良好途径。乳酸菌是一类对宿主有益的微生物,可调节肠道菌群结构,维持机体健康,被应用于各类发酵食品中,如酸奶、羊栖菜浆等[12]。本课题组前期从市售保存期较长的酸菜中分离得到一株细菌,经16S rDNA鉴定为植物乳杆菌,NCBI序列号为MT781360。经验证,该菌所产细菌素性能稳定,具有广谱抑菌性能[13]。本文旨在将植物乳杆菌L3作为协同发酵剂,研究其与市售发酵剂联合使用对发酵乳贮藏品质的影响。
试验所用原材料(伊利全脂灭菌纯牛奶、白砂糖)均购自哈尔滨市(学府路)中央红超市。
植物乳杆菌L3(L.plantarumL3)是从长期贮藏的酸菜中分离得到的一株植物乳杆菌。
市售发酵剂(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)来源于法国丹尼斯克883型。
1.2.1 L.plantarum L3菌株活化及扩培
将冷冻保藏的L.plantarumL3无菌接种于灭菌MRS液体培养基中培养,37℃恒温培养箱中培养24 h。重复3次,吸取2 mL活化L.plantarumL3培养液加入40 mL MRS液体培养基中,37℃恒温培养箱中培养24 h进行第一次扩培。再将第一次扩培后菌液40 mL全部加入800 mL MRS液体培养基中,37℃培养24 h进行第二次扩培。
1.2.2 发酵乳制备
将全脂灭菌纯牛奶、7%(g·mL-1)白砂糖混合均质,85℃条件下巴氏杀菌15 min,再将其冷却至42~45℃,将L.plantarumL3与市售发酵剂按照1∶1混合,投入鲜奶中发酵(以下简称CLFM组),分别以L.plantarumL3单独发酵(以下简称LFM组)和市售发酵剂单独发酵(以下简称CFM)鲜奶作为对照,接种量均为108cfu·mL-1,42℃下发酵,发酵完成后将发酵乳置于4℃冰箱内后熟并贮藏。
1.2.3 L.plantarum L3对发酵乳成品营养成分的影响
蛋白质测定:参照GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定[14]。
脂肪测定:参照GB 5009.6-2016中索氏抽提法测定[15]。
灰分测定:参照GB 5009.4-2016测定[16]。
总固形物测定:将培养皿烘至恒重,记质量为m1,取一定量发酵乳样品于培养皿中,记质量为m2,放入烘箱将其烘干至恒重,记质量为m3。
多糖含量测定:采用苯酚-硫酸法测定。
1.2.4 L.plantarum L3对发酵乳贮藏期间品质影响
分别测定第0、7、14和21天发酵乳。
酸度测定:称取不同组发酵乳样品10 g,记质量M,20 mL蒸馏水稀释样品,滴加酚酞作为指示剂摇匀,0.1 mol·L-1标准NaOH溶液滴定至溶液变为微红色,30 s内不变色,记录消耗的标准NaOH溶液体积V,计算样品酸度。试样中酸度数值采用以下公式计算,以吉尔涅尔度(°T)表示,记为X。每组样品取3个平行样作测定。
式中,X-试样酸度(°T);C-氢氧化钠标准溶液(mol·L-1);V-滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液体积(mL);M-试样质量(g);0.1-氢氧化钠(mol·L-1)。
持水力测定:取10 g不同组发酵样品(W1),于4℃下以955×g离心10 min,弃掉上清液,记录此时发酵乳质量(W2),每组样品取3个平行样进行测定。持水力(WHC)按照以下公式计算:
质构测定:利用TA-XT EXPRESS物性测试仪测定发酵乳硬度、胶黏性、弹性、内聚性和回复性等质构性能。具体参数如下:探头选用P/36R;设定测试距离为15.0 mm;测定前、测定时和测定后探头速度分别为5.0、2.5、2.0 mm·s-1;测定时间为5.00 s,感应力为5.0 g。每组样品取3个平行样进行测定。
pH测定:分别在发酵乳后熟12 h之后,取贮藏第0、7、14和21天发酵乳,通过pH计测定,每组样品同时测定3组平行。
活菌数测定:参照GB 4789.35-2016[17]中涂板计数法,分别在不同组发酵乳后熟12 h后,取贮藏第0、7、14和21天发酵乳,测定其活菌数,每组样品同时测定3组平行。研究不同组发酵乳贮藏期间活菌数变化情况。
感官评定:参照发酵乳食品安全国家标准GB 19302-2010[18]感官要求,利用模糊数学法作感官评定。选取10人组成感官评价小组,10位品评员由3名男性和7名女性组成,年龄在22~25岁之间,在评价前,对评定组成员进行评价标准培训,确保评价结果客观及一致性,增强评价一致性,以发酵乳气味、组织状态、色泽等为评定指标,采用10分打分法进行评价。
1.2.5 发酵乳贮藏期间霉变情况测定
分别在不同组发酵乳后熟12 h后,将发酵乳开盖贮藏在室温环境下,观察贮藏第0、7和14天发酵乳霉变情况,与相同时间在4℃封盖贮藏发酵乳对比,分析L.plantarumL3对发酵乳贮藏期间霉变程度的影响。
使用Origin 8.0软件对试验所得结果进行制图和数据统计学分析,所有数据均以平均值±标准差表示。
2.1.1 发酵乳酸度和持水力测定
根据图1A可知,CLFM和CFM在4 h同时达到发酵终点,酸度分别为(71.33±1.60)°T和(73.17±1.26)°T,LFM在9 h才达到发酵终点,酸度达(70.33±2.02)°T。以上结果表明,L.plantarumL3在CLFM牛乳中不延长其发酵完成时间,两组发酵剂均在4 h达到发酵终点,且4 h时酸度无显著差异(P>0.05)。由图1B可以看出,CLFM持水力为78.09%±0.84%;CFM持水力为75.16%±1.04%;LFM持水力为79.55±1.72%,CLFM与LFM持水力无显著差异,均显著高于CFM(P<0.05)。
图1 植物乳杆菌L3、市售发酵剂以及二者协同发酵乳酸度(A)以及持水力(B)变化Fig.1 Changes of acidity(A)and water holding capacity(B)LFM,CFM and CLFM
2.1.2 L.plantarum L3对发酵乳质构的影响
由表1可知,CLFM和LFM发酵乳硬度、胶黏性、回复性均高于CFM,说明添加L.plantarumL3作为发酵剂可提高发酵乳硬度、胶黏性和回复性,均与CFM质构特性存在显著差异性(P<0.05)。
表1 发酵乳质构特性分析Table 1 Textural characteristics analysis of different fermented milks
2.1.3 L.plantarum L3对发酵乳感官的影响
如图2A可知,协同发酵组和单独发酵组发酵乳外观无明显差异,色泽光亮、乳白色,较少或无明显乳清析出。表明L.plantarumL3作为发酵剂不会对发酵乳感官造成不利影响。
通过感官小组10分制打分法以及模糊数学法计算得到如图2B发酵乳感官得分结果,可知3组发酵乳得分均在6.5分以上,协同发酵组和市售发酵组得分均在7分以上且两者无显著差异,高于LFM得分,具有显著差异(P<0.05)。
图2 发酵乳成品(A)及其感官得分(B)Fig.2 Fermented milk products(A)and their sensory score(B)
2.1.4 L.plantarum L3对发酵乳风味的影响
图3A表明3种发酵乳组内差异不明显,不同发酵乳产品之间存在一定差异。由图3B可知,3组发酵乳气味在W1C(芳香成分,苯类)、W3C(芳香成分、氨类灵敏)、W5C(短链烷烃芳香成分灵敏)、W1W(对硫化物灵敏)中差异小;CLFM发酵乳在W2W(芳香成分,对有机硫化物灵敏)较其他两组发酵乳更加突出;LFM发酵乳在W1S(对甲基类灵敏)和W2S(对醇,醛酮灵敏)相较其他两组发酵乳更突出。
图3 电子鼻评价发酵乳PCA分析(A)其雷达图(B)Fig.3 Evaluation of fermented milk by E-nose PCA(A)and its radar chart(B)
传感器名称对应性能描述:W1C(芳香成分,苯类),W5S(灵敏度大,对氮氧化合物很灵敏),W3C(芳香成分、氨类灵敏),W6S(对氢化物有选择性),W5C(短链烷烃芳香成分灵敏),W1S(对甲基类灵敏),W1W(对硫化物灵敏),W2S(对醇,醛酮灵敏),W2W(芳香成分,对有机硫化物灵敏),W3S(对长链烷烃灵敏)。
2.2.1 L.plantarum L3对发酵乳营养成分含量的影响
由表2可知,3组发酵乳蛋白质含量均高于国标要求2.3 g·100 g-1,脂肪含量也均符合国标要求2.5 g·100 g-1以上。3组发酵乳不同指标进行显著性分析发现,各组发酵乳不同指标间均无显著差异。
表2 发酵乳成分含量分析Table 2 Fermented milk composition content analysis
以上结果表明,3组发酵乳营养物质含量均达到国家标准,不同发酵剂组间无显著差异,说明L.plantarumL3作为发酵剂使用时不会对产品营养物质含量造成不良影响,可用于发酵。
2.2.2L.plantarum L3对发酵乳多糖含量的影响
葡萄糖标准曲线方程为y=16.264x-0.0009,R2=0.9983,线性关系良好,依据该方程计算多糖含量,各发酵乳在发酵前后多糖含量见图4A,通过计算可得出发酵前3组发酵乳多糖含量分别为(425.15±12.30)、(369.87±7.76)和(442.23±11.18)μg·mL-1;发酵后多糖含量分别为(718.60±16.02)、(429.20±11.69)和(746.99±5.59)μg·mL-1;发酵前后3组发酵乳多糖含量分别升高(293.45±8.55)、(59.33±7.75)和(304.79±8.25)μg·mL-1,明显看出有L.plantarumL3参与发酵的发酵乳多糖显著增加,其中LFM最高,与3组发酵乳持水力、质构结果一致,表明添加L.plantarumL3可改善发酵乳品质与其产胞外多糖有关。
2.3.1 贮藏期发酵乳pH变化
由图4B可知,在21 d贮藏期内各组发酵乳pH均呈缓慢降低趋势,协同发酵组、CFM、LFM
pH分别由最初(4.62±0.03)、(4.67±0.04)和(4.34±0.06)下降至(4.23±0.01)、(4.22±0.02)和(4.12±0.01),3组发酵乳在贮藏期内pH分别下降(0.39±0.02)、(0.45±0.02)和(0.23±0.07)。
2.3.2 贮藏期发酵乳酸度的变化
由图4C可知,贮藏期间CLFM、CFM、LFM酸度分别由最初(73.40±4.19)、(75.00±0.50)、(79.83±1.60)°T升高至(96.50±1.00)、(101.17±3.75)、(105.17±1.61)°T。
2.3.3 贮藏期发酵乳持水力变化
由图4D可知,在第0天时3组发酵乳持水力分别为79.35%±1.45%、79.22%±1.34%、80.75%±1.25%,第7天时3组发酵乳持水力分别为73.01%±0.75%、71.84%±1.04%、73.35%±1.31%,可看出前7 d LFM持水力最高,CLFM次之,CFM最低,但并无显著差异(P>0.05);第14天时3组发酵乳持水力分别为76.11%±0.76%、72.54%±0.89%、75.34%±0.33%,L.plantarumL3参与发酵两组持水力均高于CFM,且差异显著;第21天时3组发酵乳持水力分别为74.96%±1.02%、71.23%±2.11%、71.71%±0.51%,可见,CLFM持水力均显著高于其他两组(P<0.05)。TPA模式(2次咀嚼)测定发酵乳质构是通过模拟人类咀嚼食物测定样品的质构特性。由图4E见,在21 d贮藏期3组发酵乳的硬度变化趋势相同,在21 d贮藏期内CLFM和LFM硬度均比CFM高,可能与L.plantarumL3可产胞外多糖有关,胞外多糖与蛋白质基质间发生静电相互作用,形成更加致密的网络结构,导致发酵乳硬度升高。以上结果表明添加L.plantarumL3作为发酵剂进行发酵,可提高发酵乳硬度。
2.3.4 贮藏期发酵乳质构变化
由图4F可见,CLFM和LFM胶黏性均高于CFM,3组发酵乳在21 d内变化规律呈现一致,但变化程度不同,可能与该结果的L.plantarumL3产胞外多糖有关,发酵乳胶黏性得以提高。由图4G可知,LFM弹性在21 d内呈缓慢下降趋势,相比其他两组整体弹性较小。
2.3.5 贮藏期发酵乳活菌数的变化
由图4H可知,3组发酵乳在21 d贮藏期内活菌数均高于国标要求,均在107cfu·mL-1以上,但贮藏期间活菌数整体呈下降趋势。在第0天时,CLFM活菌数菌高于其他两组,但无显著差异;7 d后CLFM活菌数较低于CFM但高于LFM;14 d时CLFM活菌数为7.55±0.11 lg(cfu·mL-1)略低于CFM活菌数7.8±0.13 lg(cfu·mL-1),无显著差异;14 d后其活菌数下降速度明显低于CFM,CLFM和CFM活菌数相差较小;21 d贮藏期内,LFM的发酵乳活菌数均低于其他两组,但仍在7 lg(cfu·mL-1)以上。
由图4I可知,在21 d的贮藏期内3组发酵乳多糖含量均升高,在第0天3组发酵乳多糖含量分别为(718.60±16.02)、(429.20±11.69)和(746.99±5.58)μg·mL-1,CLFM和LFM无显著性差异,与CFM差异显著(P<0.05);贮藏21 d之后3组发酵乳多糖含量分别为(1 849.13±13.14)、(1 210.65±21.33)和(2 048.58±16.26)μg·mL-1。
图4 发酵乳发酵前后多糖含量及其贮藏期间品质变化Fig.4 Changes of polysaccharide content in fermented milk before and after fermentation and quality during storage
由图5A可知,3组发酵乳在室温(20±5)℃开盖贮藏时,发生不同程度腐败变质。第7天时仅市售发酵剂出现明显腐败变质,发酵乳表面存在明显青色和发黄霉菌菌落,发酵乳乳清析明显,该组发酵乳品质明显变差;第14天时3组发酵乳均产生不同程度变质,CFM腐败变质最为严重,3个平行样品均发生明显腐败变质,CLFM 3个平行样品出现不同程度腐败变质,较CFM明显腐败程度低,LFM 3个平行样品均无明显腐败变质现象,仅一个样品存在霉菌菌落。
发酵乳室温(20±5)℃封盖贮藏21 d期间,仅CFM发酵乳发黄且存在青色霉菌菌落现象,其他两组无明显霉变情况(见图5B)。为保证发酵乳品质最佳,一般在4℃下贮藏和运输,酵母菌最适生长温度为20~30℃,大多数霉菌最适生长温度为25~30℃。由图5C可知,21 d贮藏期内3组发酵乳均无明显肉眼可见霉变情况。为排除偶然性,将市售发酵剂中霉变最严重的发酵乳原液回接到新鲜牛乳中,通过不同发酵剂进行发酵,观察在室温(20±5)℃开封盖贮藏14 d内霉变情况佐证L.plantarumL3对抑制发酵乳腐败变质的准确性。
图5 发酵乳室温开盖贮藏(A)、室温封盖贮藏(B)、4℃封盖贮藏(C)期间霉变情况变化Fig.5 Changes of mildew during open storage of fermented milk at room temperature(A),sealed storage at room temperature(B),and sealed storage at 4℃(C)
由图6可见,3组不同发酵剂组发酵乳在14 d内霉变情况,第7天时CFM出现明显霉菌菌落,其他两组未观察到明显霉菌菌落,且CFM出现菌落与回接样品出现菌落类似;在第14天,3组发酵乳均出现与回接样品类似的霉菌菌落,但3组发酵乳霉变程度不同,CFM 3个平行样霉变情况较重,其次是CLFM,最后是LFM,验证L.plantarumL3确实有抑制发酵乳腐败变质的性能,且效果明显。
图6 霉变发酵乳回接到鲜奶中,再用不同发酵剂发酵后酸奶在贮藏14 d期间质量变化Fig.6 Changes of quality of yogurt during storage for 14 days after the mildewed fermented milk was returned to fresh milk and then fermented with different starter agents
贮藏期间发酵乳pH和酸度变化可反映发酵乳后酸化程度。CLFM和LFM pH下降幅度均低于CFM pH下降幅度,故采用L.plantarumL3协同市售发酵剂发酵乳可降低后酸化现象。发酵结束时及贮藏期间pH均与市售发酵剂无显著差异。许女等研究发现添加植物乳杆菌MA2的酸奶后酸化程度显著降低[19],与本试验结果一致,添加L.plantarumL3发酵乳在贮藏期间pH下降幅度较CFM小,CLFM和LFM酸度上升幅度较CFM慢,以上结果表明L.plantarumL3作为发酵剂可延缓发酵乳后酸化现象。根据国标要求,发酵乳酸度需达到70°T以上,因此,本试验发酵乳发酵终点以酸度达到70°T为标准。Xue等研究表明,发酵乳凝乳时间与发酵菌株产酸能力以及产酸速率有关[20]。L.plantarumL3作为发酵剂单独发酵时发酵终点比其他两组晚,说明保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在发酵过程中发挥主要作用。
本研究中,感官评价结果表明,添加L.plantarumL3作为协同发酵剂不会对发酵乳感官造成不利影响,但L.plantarumL3单独发酵,因其pH低,口感过酸,导致该组发酵乳整体感官评分低于其他两组,因此L.plantarumL3可作为协同发酵剂参与发酵,单独作为发酵剂发酵效果相较市售发酵剂并不理想。电子鼻传感器检测到的信号强度可反映出发酵乳中挥发性物质浓度差异[21]。本试验中,添加L.plantarumL3的发酵乳中甲基类、醇类、醛酮类等气味成分增加,改善发酵乳风味。王丽萍等研究表明不同发酵剂产生不同代谢产物影响产品的风味,与本试验结果一致[22]。出现以上结果可能因发酵剂菌株改变,导致菌株共生关系发生改变,从而代谢产物(挥发性风味物质)种类和含量发生变化[23]。
持水力是评价发酵乳品质重要指标,发酵乳持水力随冷藏时间延长呈下降趋势[24]。本试验结果表明,L.plantarumL3作为协同发酵剂可提高发酵乳持水力,尤其是在贮藏期后期效果显著;L.plantarumL3作为发酵剂单独发酵时,虽然在14 d前持水力均高于CFM,但在21 d时,持水力相较其他两组下降多(下降3.63%)。Casarotti等研究表明,益生菌产胞外多糖可提高发酵乳持水力[25],本试验中发现L.plantarumL3协同发酵时可提高发酵乳持水力,在第14天和第21天时L.plantarumL3参与发酵的两组持水力均高于CFM,这可能与L.plantarumL3产胞外多糖有关,Xu等研究发现胞外多糖导致发酵乳持水力升高[26]。
研究发现持水力随pH降低而减小,这是因pH降低引起酸乳凝胶中蛋白质形成网络重新排列,导致粒子-粒子连接数量增加,凝胶收缩,乳清析出,发酵乳持水力降低[25]。本试验结果发现,发酵乳持水力随贮藏时间延长而降低,在贮藏末期,LFM的pH相对其他两组最低,其持水力比其他两组低,CLFM和LFM发酵乳硬度、胶黏性、回复性与CFM组相比均有所提高。王鑫磊等研究发现,添加马乳酒样乳杆菌ZW3可显著提高发酵乳胶黏性、咀嚼性、内聚性和恢复性,与本研究结果相似[27]。以上结果表明,添加L.plantarumL3作为协同发酵剂可明显改善发酵乳质构性能,使发酵乳具有更好稳定性。
发酵乳质构是发酵乳品质评价关键指标,可反映发酵乳内部组织状态。CLFM弹性在21 d内呈现先升后降趋势,第21天时弹性最低,说明发酵乳最初弹性较高,但在贮藏期后期弹性降低快,分析原因可能与L.plantarumL3协同发酵时产生胞外多糖有关,产生胞外多糖使其发酵乳组织状态稳定。CFM发酵乳在第0天和第21天时弹性高,在第7天和第14天弹性与LFM相似,此过程说明CFM在21 d的贮藏期内发酵乳组织结构由最初稳定性差到稳定性变好再到变差,贮藏期后期稳定性相较其他两组更差。Lang等研究表明,添加植物乳杆菌A3可提高酸奶感官品质,与本试验结果相似,添加L.plantarumL3参与发酵可降低发酵乳弹性,使发酵乳具有更稳定结构[23]。乳酸菌代谢产生EPS可使发酵乳质地均匀细腻、口感细滑、减少乳清析出,目前已成为发酵乳制品中新型添加剂,Hu等研究发酵乳在贮藏期内多糖含量变化可解释发酵乳贮藏期间部分品质变化[28]。
发酵乳贮藏第7天到第21天内LFM多糖含量最高,其次是CLFM,最后是CFM,且差异显著(P<0.05)。以上结果与持水力、质构等结果一致,说明L.plantarumL3在生长代谢过程中可产生胞外多糖,可提高发酵乳持水力、质构特性等,改善发酵乳品质。
综合质构分析结果,添加L.plantarumL3进行发酵,可提高发酵乳硬度、胶黏性,降低发酵乳弹性,发酵乳品质更稳定,可延缓发酵乳货架期。
CLFM和CFM在4 h同时达到发酵终点,LFM在9 h达到发酵终点;L.plantarumL3协同发酵可提高发酵乳持水力、质构性能、多糖含量、挥发性风味物质,使发酵乳具有更稳定组织状态,不会对发酵乳感官评价产生负面影响,可改善发酵乳后酸化现象,延长发酵乳货架期。L.plantarumL3可增强发酵乳对病原菌的抑制,有效抑制发酵乳中腐败变质。综上所述,L.plantarumL3作为协同发酵剂,发酵乳获得更好的感官、营养和贮藏品质。