茶多酚对人牙槽骨成骨细胞相关基因表达的影响

范 芹，谢 巍，刘建国，曾凤娇，白国辉，黄伟琨，管晓燕

(1.遵义医科大学附属口腔医院 种植科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属口腔医院 正畸科，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学 贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563099；4.邯郸市口腔医院 牙周科，河北 邯郸 056000)

茶多酚(Tea polyphenols，TP)大量存在于茶叶中，是茶叶中酚类化合物的总称。TP的生物学功能多种多样，包括抗肿瘤、抗氧化、降血糖、增强免疫力等，且具有不产生耐药性、毒性低等优点，已成为近年来医疗卫生领域研究的热点[1]。口腔种植技术是近年来逐渐发展起来新兴技术，通过手术的方式将人工植体植入颌骨内替代人工牙根，成为了临床用于缺失牙的主要治疗方案[2]。种植体理想的愈合方式是植体与骨组织形成骨结合，骨组织保持良好的成骨与破骨状态的平衡是口腔种植术成功的关键[3]。

人牙槽骨成骨细胞(Human alveolar osteoblasts，HAOB)，是由间充质始祖细胞分化而来的与骨组织功能相关的主要细胞[4]。在骨的形成及改建过程中，成骨细胞特异性分泌多种生物活性物质如转录因子、生长因子等，调节并影响骨的形成和重建。成骨细胞特异性转录因子(Osterix，OSX)只在骨组织中特异性表达，在干细胞分化形成成骨细胞过程中起决定性作用，没有OSX就没有骨形成和骨再生[5-6]。组织非特异性碱性磷酸酶(Tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP)是一种非特异性磷酸单酯酶，主要在肝脏、骨组织和肾脏中高度表达,骨组织中的TNAP在骨矿化过程提供磷酸盐，是成骨细胞(Osteoblasts ，OB)分化早期的标志[7-8]。骨钙素(Osteocalcin，OCN)是一种特异性非胶原基质蛋白，由成骨细胞生成并特异性分泌，能够调节骨中钙的分泌从而影响骨的形成和钙化[9-10]。

本研究通过观察不同浓度TP对HAOB相关基因OSX，TNAP和OCN基因表达的影响，初步探讨TP调节人牙槽骨恢复和再生的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要实验材料 茶多酚(Solarbio，中国)，Purity≥98.0%。

1.1.2 样本来源及纳入标准 样本采集对象为遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科就诊患者。纳入标准：①阻生牙、正畸拔除牙；②无牙周及根尖病变；③未服用影响骨代谢药物；④排除骨代谢相关疾病。术前告知患者情况，与患者签订知情同意书。样本采集：收集牙拔除后牙槽窝内壁少量的牙槽骨，置于预冷的含青链霉素的低糖DMEM培养液，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配置及分组 TP母液配置(1 mg/mL)：称取10 mg TP溶于10 mL DMEM完全培养基(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的低糖DMEM培养基)中，充分混匀制成1 mg/mL的母液，0.22 μm针头式滤器过滤，用DMEM完全培养基进行浓度稀释，分为0.1、1.0、10 μg/mL TP组、对照组(无TP的DMEM完全培养基)，用以上培养基分别培养细胞。

1.2.2 样本收集及HAOB鉴定 分离原代HAOB细胞(37 ℃、5%CO2)，显微镜下观察记录细胞形态。细胞鉴定：经偶氮偶联法及茜素红S染色法进行对成骨细胞进行染色，鉴定完成后，传代培养至第3代备用。制备单细胞悬液，0.4%台盼蓝染色，血球计数板计数。细胞悬液(2×105/mL)3 mL接种至6 cm培养皿中培养，24 h后各实验组加入相应浓度的TP，共培养24、48、72 h。

1.2.3 cDNA的获取 根据RNAiso Plus(TaKaRa)说明书提取RNA，调整为100 ng/μL的RNA样本后，根据PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)中10 μL反应体系，将RNA逆转录为cDNA。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃，5 sec。

1.2.4 引物的设计与合成 根据NCBI数据库，获得OSX、TNAP和OCN基因序列，设计引物序列(见表1)后，由上海生工生物工程公司完成合成。

表1 引物序列

1.2.5 qRT-PCR检测HAOB相关基因表达 以OSX、TNAP和OCN基因的cDNA为模板进行qRT-PCR检测，反应体系按照SYBR® Premix Ex TaqTM(TaKaRa)20 μL配制。反应条件：预变性：95 ℃、30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃处理30 s(40 Cycle)；延伸72 ℃、30 s。

2 结果

2.1 HAOB鉴定结果 HAOB能偶合成并分泌ALP，大部分HAOB细胞胞浆中可观察到呈现被染成淡蓝色的片状及团块状阳性颗粒(见图1)。OB具有体外矿化的特征，经肉眼观察可看到到白色矿化结节的形成。通过茜素红钙染色后，矿化结节染色呈橘红色，形状不规则，大小不一(见图2)。因此，通过鉴定可以确定分离培养的细胞为纯化的HAOB细胞，可用于后续实验。

图1 人牙槽骨成骨细胞碱性磷酸酶染色(×200)

图2 人牙槽骨成骨细胞茜素红钙染色(×100)

2.2 RNA质量检测结果 通过凝胶电泳图显示，总RNA的OD260/OD280比值为1.8～2.0，说明RNA无降解无污染，可作为qRT-PCR的模板，用于后续实验。

2.3 HAOB相关基因表达结果

2.3.1OSX、TNAP、OCN熔解曲线OSX、TNAP、OCN基因的熔解曲线均为单峰(见图3～6)，说明4个基因的引物特异性好，无非特异性扩增。

图3 GAPDH的熔解曲线

图4 OSX基因的熔解曲线

图5 TNAP基因的熔解曲线

图6 OCN基因的熔解曲线

2.3.2OSX的相对表达量 在24 h和48 h时，各实验组的表达量均低于对照组(P<0.05)；在72 h时，1.0 μg/mL TP组的表达量高于对照组(P<0.05)，而10 μg/mL TP组的表达量低于对照组(P<0.05)。其他组比较差异无统计学意义(见图7)。

*：与同时段相应对照组比较，P<0.05。图7 TP对OSX相对表达量的影响

2.3.3TNAP的相对表达量 在24 h时，与对照组相比，0.1、1.0、10 μg/mL TP组TNAP的表达量均低于对照组(P<0.05)；在48 h时，0.1、10 μg/mL TP组的相对表达量低于对照组(P<0.05)，但1.0 μg/mL TP组略高于对照组(P> 0.05)；在72 h时可观察到与对照组相比，1.0 μg/mL TP组略低于对照组(P> 0.05)，0.1、10 μg/mL TP组低于对照组(P<0.05)。其他组比较差异无统计学意义(见图8)。

*：与同时段相应对照组比较，P<0.05。图8 TP对TNAP相对表达量的影响

2.3.4OCN的相对表达量 在24 h时，0.1、10 μg/mL TP组的OCN相对表达量低于对照组(P<0.05)，1.0 μg/mL TP组的相对表达量略高于对照组(P> 0.05)；在48 h时，与对照度相比，其余各组表达量均低(P<0.05)；在72 h时，与对照组相比，1.0 μg/mL TP组的相对表达量高(P<0.05)，0.1、10 μg/mL TP组的表达量低(P<0.05，见图9)。

*：与同时段相应对照组比较，P<0.05。图9 TP对OCN相对表达量的影响

3 讨论

口腔种植技术的快速发展使得种植牙成为人们治疗缺失牙的首选方案，种植体的稳定性及良好的愈后是当前口腔医生的难题。人牙槽骨具有高度可塑性，通过手术方法将种植体植入缺牙区牙槽骨，保证骨组织与种植体形成良好的骨结合成为了植体成功的关键[11]。TP是茶叶中的多酚类化合物的总称，来源广泛，取材方便，研究表明TP在抗氧化应激、抗肿瘤、抗衰老、抗炎抗菌方面都具有较好的作用[12]。近些年来TP在口腔方面的应用主要集中于抗菌、抗炎方面[13]，关于TP对成骨作用的研究还鲜有报道。本研究的出发点在于将TP作用于人牙槽骨成骨细胞，通过共培养后观察TP对于与成骨增殖分化相关因子的作用。

OSX不仅可以促进OB分化，而且还可以使OB发生异位矿化[14]。研究证实OSX对OB的分化具有双向调控作用，一方面，发挥正向调节作用，适量的OSX可以促进OB的成熟、分化，从而促进骨形成。另一方面，发挥负向调控作用，OSX可以对Wnt通路产生抑制作用，从而抑制OB的增殖。因此，只有适量表达的OSX才能对OB的分化、成熟具有积极的作用。本实验研究发现，在细胞增殖旺盛时期，OSX的表达量较低，TP可能抑制OSX的表达。在第3天，适宜浓度的TP促进了OSX的表达。TNAP表达的ALP，是OB分泌的一种酶类蛋白，能够作为一种生物标记物反应OB的分化、成熟状态[15]。实验发现，第3天在适宜浓度TP作用下TNAP的表达增强。分化成熟的成骨细胞能够合成并分泌骨钙素，开始表达于矿化早期，在矿化结节成熟后达到高峰，可以调节骨矿化过程。在本实验结果中可以观察到从第3天开始，适宜浓度TP的影响下，OCN的表达增强。

HAOB是骨形成的功能细胞，大量研究表明其可作为体外研究物质对骨组织生物学的影响[16]。本研究选用人健康牙槽骨进行体外分离原代培养HAOB，而不是细胞株或动物原代细胞，对TP的临床应用更具指导意义[17]。本实验采用qRT- PCR初步探讨TP调节HAOB可能的分子机制，观察不同浓度TP对体外培养HAOB的OSX、TNAP和OCN基因表达的影响，初步探讨TP调节人牙槽骨恢复和再生的可行性，但OB的增殖和分化受多种因素影响，还需进一步实验探索TP对于成骨细胞分化相关基因的表达是否有促进作用，且TP对骨形成基因表达的长期效果还需进一步探讨。