基于“肝肠同治”理论探讨软肝散加味方调控肠道菌群治疗肝纤维化的作用机制

张 禹，张 弓，杨沈秋，黄秋思，李佳泽，邵忠林

(黑龙江中医药大学附属第二医院·黑龙江 哈尔滨 150001)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝内结缔组织异常增生的病理过程，也是多种肝病发展至肝硬化的必经阶段[1-2]。肠道菌群系统是人体最复杂的系统之一，肠道菌群可以从内毒素血症及肠-肝轴等多种途径影响宿主的健康，菌群紊乱常发生在慢性肝病早期，及时调整菌群结构，可有效缓解肝脏病变及并发症的发生[3-4]。

肝纤维化在中医学古籍中并没有明确记载，但关于肝纤维化病因病机中肝脾关系及肝与大肠的关系确有迹可循，如《医学入门》中提出“肝与大肠相通”。中医的脾，主要包括现代医学中的整个消化系统，故在临证中既要重视治肝，更要重视对脾的治疗，做到未病先防。肠道是脾实现功能的主要部位[5]，故肠道微生态一定程度上体现了中土思想[6]。

前期实验研究已经证实软肝散加味方可降低肝纤维化模型大鼠HIF-1α、VEGF、NF-κB及TGF-β的表达[7-11]。为进一步探讨软肝散加味方对肝纤维化大鼠肠道菌群的影响，本次研究在“肝肠同治”的理论指导下使用软肝散加味方进行干预，观察肝纤维化大鼠肝脏病理、肠道内毒素含量、OTUs数量及alpha与beta多样性的变化，探讨软肝散加味方治疗肝纤维化的分子机制。

1 材料

1.1 动物 选择健康清洁级雄性SD大鼠66 只，8～10 周龄，体质量(200±30)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK(黑)2018-004。自由饮食水，室内温度为20～25 ℃，相对湿度为40%～60%，适应饲养7 d后开始实验。

1.2 实验药物 软肝散加味方由丹参15 g、茯苓15 g、炙鳖甲20 g、生牡蛎30 g、党参30 g、白芍15 g、炒白术12 g、炙甘草10 g、山药30 g共9 味中药组成。药材由黑龙江中医药大学附属第二医院饮片药房提供，且符合2020年版《中国药典》相关规定；上述所有饮片煎煮前浸泡1 h，先煎炙鳖甲与生牡蛎40 min，再加上述其余草药共同煎煮，水煎液浓缩至5.175 g/mL，置4 ℃冰箱备用[12]。

1.3 实验试剂与仪器 无菌猪血清：广州鸿泉生物科技有限公司提供，批号 20200101；山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP、GAPDH、鼠单抗：天德悦生物科技有限公司提供；内毒素检测鲎试剂盒：厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。2135型切片机：德国莱卡；902-ULTS超低温冰箱、scientific NANODROP 2000分光光度计：美国Therm公司；TECAN M200pro酶标仪：由瑞士TECAN公司； Applied BiosystemsABI7500荧光定量PCR仪：由杭州朗基科学仪器有限公司；Eclipse TE2000-E 倒置显微镜：尼康仪器有限公司。

2 方法

2.1 造模及分组给药 选择SD大鼠66只，其中正常对照组12只，剩余54只进行造模。采用未灭活的猪血清腹腔注射，每次0.5 mL/只，每周2 次。固定时间为周二、周五上午9∶00，连续8周；正常对照组每只大鼠腹腔注射0.5 mL生理盐水。造模结束后，随机抽取6只造模大鼠及正常对照组大鼠6只取材做病理，证实模型制作成功。48只造模成功的大鼠随机分为模型组、软肝散加味方高剂量组、软肝散加味方中剂量组、软肝散加味方低剂量组4组，每组12只。低、中、高剂量组大鼠日给药量分别为20.7、41.4、82.8 g/kg，正常组及模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续8周。

2.2 标本采集 给药结束后，每组大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛3.8 mL/kg腹腔注射，麻醉后腹主动脉取血，4 ℃，3 000 r/min离心15 min，离心半径15 cm, 取上清，4 ℃保存。迅速解剖取出肝脏，观察肝脏的颜色、质地，沿肝脏长轴切取约2 mm厚的肝组织放入10%甲醛溶液中固定，常规制备肝组织切片；再分别取肝脏组织100 g于液氮中速冻，再转移至-80 ℃超低温冰箱中保存。取盲肠部位内容物于无菌冻存管中，液氮速冻，存于-80 ℃超低温冰箱中，干冰送检。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 HE染色观察病理学变化 肝组织按顺序包埋成块，切片厚4 μm，经苏木素染色5 min，自来水及酒精冲洗；90%伊红醇溶液中5 min；无水酒精、二甲苯及两次各5 min；中性树胶封片，显微镜下观察。

2.3.2 鲎试剂法检测肠道内毒素的含量 取粪便约1 g，加入细菌内毒素检验用水1 mL，3 000 g离心10 min收集上清液，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，计算样品中内毒素浓度。

2.3.3 肠道菌群多样性分析 提取各组大鼠粪便样品总DNA，通过PCR扩增16SrRNA基因的V3-V4区(98 ℃持续30 s，然后进行35 个循环，分别是98 ℃持续10 s，54 ℃持续30 s，72 ℃持续45 s，72 ℃持续10 min，4 ℃)，纯化PCR产物。采用Illumina MiSeq测序平台进行测序，结果进行OTU划分及Venn图分析；Alpha多样性法比较组间菌群丰度及多样性差异；分类学组成分析组间不同水平菌群差异；β多样性分析组间菌群的相似性及差异。

3 结果

3.1 软肝散加味方对肝纤维化大鼠肝脏病理变化的影响 HE染色显示，正常组肝细胞板排列规整。模型组大鼠肝小叶结构严重破坏，肝细胞排列紊乱，肝组织汇管区及中央静脉周围有较多纤维组织增生，说明造模成功。各给药组肝组织病理改变有不同程度的改善，其中以高剂量组改善最为明显，表现为炎细胞明显减少，胞质融合减轻，低剂量组改善较差。见图1。

图1 各组大鼠肝脏病理变化(HE，×200)

3.2 软肝散加味方对肝纤维化大鼠肠道内毒素含量的影响 见表1。

表1 各组大鼠肠道内毒素含量比较

3.3 软肝散加味方对肝纤维化大鼠肠道菌群的影响

3.3.1 OTU划分及Venn图分析 见图2。与模型组比较，软肝散加味方给药组大鼠的门、纲、目、科、属、种6类OTUs地位丰度明显回调。

3.3.2 肠道菌群α多样性分析α多样性 主要通过Chao1、Observed species、shannon、Simpson等指数反映丰富度和均匀性。Chao1、Observed species指数主要反映物种丰富度；Simpson、Shannon主要体现物种丰富度和均匀度。与模型组比较，软肝散加味方组大鼠肠道菌群丰富度指数与多样性指数显著回调(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠肠道菌群α多样性的比较

3.3.3 肠道菌群β多样性分析 采用主成分分析(PCA)考察大鼠肠道菌群β多样性的差异。与正常组比较，模型组大鼠菌群明显分开，两组菌群结构具有显著差异。高、中剂量组均趋向于正常组，两者存在一定亲缘关系。见图3。

图3 各组大鼠肠道菌群的PCA及PCoA分析

3.3.4 肠道菌群与结构分析 肠道菌群在菌门水平上，与正常组比较，模型组大鼠肠道菌群具有显著性差异的菌门有11 个(P<0.05、0.01)，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Tenericutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、Elusimicrobia下调，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、大肠杆菌门(Epsilonbacteraeota)上调，软肝散加味方各给药组可著性回调这11个菌门(P<0.05、0.01)。

肠道菌群在菌属水平上，与空白组比较，模型组大鼠肠道菌群具有显著性差异的菌属有14 个(P<0.05、0.01)，Alloprevotella、Roseburia、coccaceae_UCG-005、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Parasutterella下调，Prevotellaceae_Ga6A1_group、拟杆菌属(Bacteroides)、 Clostridium_sensu_stricto_1、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Romboutsia、Escherichia-Shigella、Veillonella、Parabacteroides、乳杆菌属(Lactobacillus)上调，软肝散加味方各给药组可著性回调这14个菌属(P<0.05、0.01)。

4 讨论

肠道菌群是指寄居胃肠道中的各种微生物的总称，人类肠道有多达400～1 000种不同的微生物[13]。稳定的微生物群是健康的标志，而菌群失调和多种疾病有关，例如本课题组重点研究的肝脏纤维化[14-15]。来自小肠和大肠的静脉血通过门静脉汇入肝脏，使肝脏容易受到来自肠道内各种抗原的刺激[9]，当肠道稳态失调发生后，肠道菌群过度生长，增加致病菌的比例，或肠道防御屏障减弱，增加肠道黏膜对内毒素的通透性，造成LPS异位[16-17]。内毒素在进入肝脏后可以和肝细胞上的模式识别受体TLR4结合[18]，启动LPS/TLR4途径[19-20]，使髓样分化因子88(MyD88)行信号转导，进一步激活NF-κB 和AP-1，引起IFN-α、IL-1 等炎性因子的分泌，导致肝脏纤维化的发生。

肝纤维化在中医学常归纳为“胁痛”“肝着”“黄疸”等疾病范畴[21]。基本病机可概括为肝脾功能失调，肝郁乘脾，脾失健运，肝郁脾虚日久而致痰阻血瘀；病位当以肝、脾二脏为主。临床上以疏肝健脾活血为主要原则进行治疗，在疏肝的同时，更要注重对脾胃肠的调补，中气得健，肝气得疏，血瘀之证自除。软肝散加味方以“肝肠同治”理论为基础，方中以丹参、鳖甲、牡蛎为君药，三药合用活血祛瘀、软坚散结之效尤佳；臣以补气健脾之四君子汤，补气健脾，调节肠道功能；四味臣药合用体现出对调养脾胃及肠道功能的重视，防止疾病进一步传变，佐以山药、白芍柔肝健脾，在协助君药活血散结的同时，又可顾护脾胃及肠道的功能。

为明确基于“肝肠同治”理论的软肝散加味方调控肠道菌群治疗肝纤维化的作用机制，本课题组通过研究发现，与模型组比较，各给药组肝组织病理改变有不同程度的改善，其中以高剂量组改善最为明显，低剂量组改善较差。与模型组比较，软肝散加味方给药各组大鼠的门、纲、目、科、属、种六类OTUs地位丰度明显恢复；对肠道菌群的丰富度、多样性指数明显回调，且高、中剂量组改善明显，说明疗效上具有一定剂量相关性。从菌门与菌属结构分析，软肝散加味方各给药组可使拟杆菌门、厚壁菌门等7个菌门下调，变形菌门、放线菌门等4个菌门上调；使异普氏杆菌属等5个菌属下调，双歧杆菌属等9个菌属上调，肠道菌群的丰富度、多样性指数与肠道菌门、菌属的分布结构具有一定相关性。

综上所述，基于“肝肠同治”理论的软肝散加味方可通过调节肠道菌群有效改善模型大鼠纤维化病理程度，减少肠道内毒素生成，抑制LPS/TLR4/NF-κB信号通路的传导，改善肝纤维化模型大鼠OTUs数量及α与β多样性的失调，恢复菌群生物丰富度、多样性指数与菌门、菌属的分布结构，达到防治肝纤维化的发生。今后本课题组还将进一步研究软肝散加味方调控肠道菌群治疗肝纤维化的机制，为“肝肠同治”理论在肝纤维化中的应用提供更多科学依据。