变质原料乳中假单胞菌的分离鉴定及产蛋白酶特性研究

胡少震，李莲瑞

1 塔里木大学生命科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300

2 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300

3 塔里木畜牧科技兵团重点试验室，新疆阿拉尔 843300

关键字：变质原料乳；假单胞菌；分离鉴定；蛋白酶活力

0 引言

原料乳是各种乳制品的基本原料，其质量是保证乳制品安全的关键因素[1]。原料乳中含有丰富的营养物质，是天然的微生物培养基，极适合微生物的生长繁殖[2]。随着冷链技术在食品运输中的广泛应用，嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等一些嗜温、嗜热微生物生长受到抑制，而具有嗜冷特性的细菌可以在低温下继续生长，成为原料乳中的优势菌[3]，该菌可通过在MPC琼脂板上6.5 ℃培养10 d进行靶向分离。假单胞菌作为原料乳的主要污染嗜冷菌，80%的假单胞都携带aprX基因位点[4]，该基因可以表达胞外金属蛋白酶，这些酶具有热不敏感性，即使通过135 ℃ 1 min热处理，酶残留率仍超过20%以上[5]，这些残留的蛋白酶会导致乳制品在货架期出现乳样变酸、乳清析出、蛋白聚集、脂肪上浮等不良现象，严重破坏乳品品质，造成巨大的经济损失[6]。本研究通过对变质原料乳中嗜冷微生物分离鉴定，明确造成原料乳发生质量问题的关键微生物，并测定了其蛋白酶活力，对原料乳的变质机理提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和设备

1.1.1 试剂

异常原料乳样品：出现蛋白水解、脂肪上浮、变酸等现象，用于污染菌株的分离鉴定，由广东省恒远市规模化牧场提供。

培养基：MPC琼脂培养基，北京依珊汇通科技有限公司；LB液体培养基、脱脂乳琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

试剂：蛋白胨盐溶液，北京奥博星生物技术有限责任公司；细菌基因组提取试剂盒、Lysozyme （50 mg/mL）、Trans2K® Plus II DNA Marker、2x Taq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖、GeneGreen核酸染料，金连宝生物技术（北京）有限公司；PBS 缓冲液（50 mmol/L）、溴酚蓝、β-巯基乙醇、2x Laemmli Sample Buffer、甲醇、冰醋酸、考马斯亮蓝有R-250，北京广达恒益科技有限公司；偶氮酪蛋白，上海源叶生物科技有限公司；SurePAGE， Bis-Tris， 10%， 10 wells、Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder，南京金斯瑞生物科技有限公司。

偶氮酪蛋白（15 g/L）：取0.15 g偶氮酪蛋白用10 mL无菌水定容。

考马斯亮蓝溶液：称取0.125 g考马斯亮蓝R-250溶于dd H2O中，加入30 mL甲醇，10 mL冰醋酸，最后加ddH2O定容至100 mL。

脱色液：甲醇30 mL，冰乙酸10 mL，加dd H2O至100 mL。

1.1.2 设备

超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；电热恒温培养箱，上海恒科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；水浴锅，宁波新芝科技有限公司；ABI 9700 PCR仪，ThermoFisher公司；高速台式冷冻离心机，北京维根技术有限公司；TACAN全波长酶标仪，帝肯（上海）贸易有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料乳中蛋白质的水解测定

通过SDS-PAGE凝胶电泳对原料乳中蛋白质水解进行测定[7]，具体方法如下：

样品准备：（1）a液：原料乳与去离子水按照1∶15混合为样品处理液（a液）。（2）b液：溴酚蓝与β-巯基乙醇按照1∶1混合。（3）c液：b液与2x Laemmli Sample Buffer 按照1∶1混合。（4） d液：c液与样品处理液（a液）各取20 μL混合。（5）将上述d液于水浴锅中100 ℃加热5 min，备用。

电泳：将加热处理后的d液用移液枪吸取10 μL在SurePAGE， Bis-Tris，10%，10 wells中进行点样，点样后放置在Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder中110 V电泳30 min。

染色，洗脱：使用Coomassie亮蓝溶液对凝胶进行染色1 h，脱色液过夜脱色。

1.2.2 原料乳中假单胞的分离纯化鉴定

样品处理：为保证平板上长出单一菌落，将变质原料乳按10倍梯度连续稀释3 次，将稀释后样品均匀涂布在MPC琼脂板培养基上，6.5 ℃恒温培养箱培养10 d。

分离纯化：将大小形态不一样的单菌落于营养肉汤液体培养基中28 ℃培养48 h，连续培养两代，对分离的细菌进行制片，革兰氏染色，观察其形态。此外，把生长为对数期的菌株用25%（v/v）的甘油保存至-20 ℃冰箱。

DNA提取：按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取培养细菌的DNA，放置-20 ℃冰箱保存。

P C R扩增：利用上述提取的基因组作为模板，1 6 S r D N A通用引物（2 7 F：5' - AGAGTTGATCCTGGCTCAG - 3' 和 1492R： 5' - CGGTACCTTGTTACGACTT - 3'）进行细菌16S rDNA全长的扩增。扩增体系和条件如表1、图1所示，扩增产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

图1 PCR扩增条件

表1 PCR扩增体系

序列比对：将测序序列进行拼接，完整的16S rDNA序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，确定该菌的种属。

1.2.3 蛋白酶活力检测

本试验分别采用10%的脱脂奶粉平板对菌液中蛋白酶进行可视化检测，偶氮酪蛋白法对菌液中蛋白酶活力进行定性检测[8]。

蛋白酶的可视化检测：（1）菌株的活化：将甘油保存的菌株接种至LB液体培养基中，28 ℃培养24 h，传代两次。（2）脱脂乳平板的配置：称取10 g脱脂奶粉，1.5 g琼脂粉于锥形瓶中加去离子水至100 mL，115 ℃灭菌10 min，倒平板备用。（3）菌液的接种：灭菌的牛津杯放置平板中，吸取200 μL菌液接种牛津杯中，将平板放入28 ℃培养箱中24 h，观察其水解圈。

蛋白酶残留率测定：（1）将活化后菌液经135 ℃加热5 s，热处理后立即冰浴，用于蛋白酶耐热性研究，对照组为未热处理的菌液。（2）各取100 μL热处理菌液和未处理菌液于2 mL无菌离心管中。（3）分别加入500 μL PBS 缓冲液（50 mmol/L），100 μL偶氮酪蛋白溶液（15 g/L）振荡混匀，37 ℃反应60 min。（4）加入500 μL TCA（0.2 g/mL）室温下静置 30 min终止反应后。（5）将终止反应液于10 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min。（6）取100 μL上清至96孔板中，对照组采用100 μL无菌 PBS代替上清液，在366 nm下将96孔板于酶标仪中测定吸光值。

蛋白酶耐热性以酶活残余率表示，酶活残余率（RA）按照下述公式进行计算：

其中，RA：酶活残余率（%）；HA：热处理后蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；IA：未处理初始蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；蛋白酶活以每毫升的粗酶液每小时吸光度的增加值表示（ΔΑ/h·mL）。

2 结果与分析

2.1 变质原料乳中蛋白质的水解测定

通过SDS-PAGE凝胶电泳对变质原料乳中的蛋白进行表征，结果如图2所示。其中，变质原料乳的乳铁蛋白、血清白蛋白无电泳条带，κ-酪蛋白电泳条带极其浅，ɑ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有较清晰的电泳条带。结果表明乳铁蛋白、血清白蛋白已经完全被水解，K-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有部分被水解，说明原料乳中微生物产生的蛋白酶较复杂，含有多个蛋白的识别位点，可将多种蛋白质水解成多种氨基酸小分子物质[9]。

图2 原料乳蛋白质水解图

2.2 分离、纯化、染色结果

将原料乳进行梯度稀释后，6.5 ℃恒温培养箱中培养10 d，结果如图3所示。菌落比较单一，菌落形态为白色、表面光滑、隆起、有光泽、不透明。挑取两株菌（S1、S2）28 ℃培养24 h，传代两次革兰氏染色如图4，该菌株为革兰氏阴性菌、形状为短杆状。

图3 菌落形态

图4 革兰氏染色结果

2.3 分离纯化的菌株16S rDNA 扩增结果

提取分离菌株的DNA，用细菌通用引物16S rDNA对其扩增，PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图5。该菌的16S rDNA 基因大小约为1 500 bp，与预期大小相符，送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

图5 电泳结果

2.4 分离菌株的鉴定结果

将测序序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，判定分离菌株的物种，比对结果见表2，两株分离菌株均为霍氏假单胞菌。通过对提交的序列进行进化树的绘制，如图6所示。该菌株与登陆号为NR_024911.1霍氏假单胞菌序列相似度为100%，可以确定这两株分离菌株为霍氏假单胞菌。

表2 两株菌BLAST结果

图6 分离菌株的进化树

2.5 蛋白酶活力检测结果

图7为霍氏假单胞菌的可视化鉴定结果，该菌株的水解圈为（15.35±0.56）mm。通过135 ℃加热5 s后，蛋白酶残留率为43.63%，说明该菌产生的蛋白酶即使经过高温钝化仍保持较高的酶活力，它的存在会水解乳中的蛋白质，造成一定的质量问题，因此应该加大对该菌的防控。

图7 蛋白酶对脱脂乳的水解圈

3 讨论

随着冷链技术在食品领域的广泛应用，嗜温微生物生长受到抑制。嗜冷菌在长期进化中通过膜蛋白的磷酸化、去磷酸化等体内的一切复杂代谢反应完成对温度的感知，减少冷休克蛋白生产，防止非必要的蛋白生成，可以在低温下生长，成为原料乳的优势菌[10]。目前，已有人从低温冷藏的原料乳中鉴定出隶属于61 个属169 个种的分离株，其中假单胞菌为主要的嗜冷菌[11]。它可以分泌一些胞外蛋白酶，这些酶具有热不敏感性，即使通过高温处理仍有较高的酶残留率，会对长期保存的乳及乳制品持续破坏，出现凝胶、沉淀、苦味或酸味等现象[12]。

原料乳随着保存时间的延长，假单胞菌的丰度不断升高。大多数假单胞菌的存在会产生水解原料乳的蛋白酶，且该菌株的总数和蛋白酶活力呈现正相关[13]。徐煜等[14]对原料乳中嗜冷菌进行分离鉴定及蛋白酶活力检测，结果显示，在分离到的假单胞菌中，66.67%（36/54）假单胞菌都能产生胞外蛋白酶，并且所产的蛋白酶都有一定的耐热能力，将分离鉴定的假单胞菌按照浓度为103CFU/mL接种到脱脂奶中，6 ℃培养5 d就能使脱脂乳溶液产生沉淀。本试验结果与前人相似，变质原料乳中分离到的微生物为霍氏假单胞菌，并且该菌有较强的蛋白水解能力。因此，原料乳变质的原因可能是该菌产生的胞外蛋白酶分解乳中的蛋白质，从而使原料乳出现蛋白水解现象。牧场应加大对假单胞菌的防范措施。

4 结论

本试验通过对变质原料乳中的微生物进行分离、纯化、鉴定，发现可能引发原料乳变质的细菌为霍氏假单胞菌，并且该菌有较强的蛋白水解能力。