唐丽萍,曾于恒 ,王容容 ,柏正平
(1.湖南中医药大学研究生院,湖南 长沙 410208;2.厦门市中医院,福建 厦门 361015;3.湖南省中医药研究院,湖南 长沙 410006)
慢性非萎缩性胃炎(Chronic non-atrophic gastritis,CNAG)的发病率逐年攀升,当其病情进展至慢性萎缩性胃炎或胃溃疡时,则可能发生癌变,严重影响患者生活质量[1-2]。CNAG患者可见胃黏膜充血水肿,伴有黏膜层大量浆细胞和淋巴细胞浸润[3]。现如今临床上仍未有理想的治疗CNAG方法。中医诊治思想中的“未病先治,既病防变”在防止CNAG的发生发展有明显的优势[4-5]。香仁胃舒汤由木香、砂仁、枳壳、厚朴等药组成,诸药合用,共宣疏肝、健脾、和胃之效。临床上对CNAG患者用香仁胃舒汤治疗取得一定成效,但其作用机制尚不明确[6]。有研究报道JAK2/STAT3信号通路在CNAG发病机制中具有重要作用[7]。本研究将基于JAK2/STAT3信号通路探讨香仁胃舒汤对CNAG大鼠的作用机制,以期为临床治疗CNAG提供参考。
1.1 实验大鼠 选取SPF级SD雄性大鼠60只,体重约200 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2019-004。本实验经医院实验动物管理委员会审核并批准。
1.2 药物与试剂 香仁胃舒汤由木香、砂仁、枳壳、厚朴、乌药、莱菔子、鸡内金、党参、白术、佛手、郁金、黄芩、蒲公英、白芍、沉香及炙甘草组成,购自亳州市方珍中药饮片厂。奥美拉唑肠溶片购自江苏联环药业股份有限公司(国药准字H10890267);水杨酸钠(山东多聚化学有限公司);氨水(济南富浩化工有限公司);脱氧胆酸钠(山东科建化工有限公司);苏木素-伊红(HE)试剂盒(上海科博瑞生物科技有限公司);P-JAK2、JAK2、STAT3一抗(北京博奥森),二抗(中杉金桥);大鼠P-JAK2、JAK2、STAT3酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海研辉有限公司);白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)大鼠ELISA试剂盒(欣博盛生物技术有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(上海抚生实业有限公司)。
1.3 实验仪器 Olympus CX23正置显微镜(济南千司生物技术有限公司);BECKMAN X-30R高速冷冻离心机(美国贝克曼);Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司);BEP-300l电泳槽(济南博坤科学仪器有限公司);Tanon-n2500全自动数码凝胶图像分析仪(济南千司生物技术有限公司)。
1.4 造模、分组与给药
1.4.1 建立模型:以化学刺激联合饥饱失常法构建CNAG大鼠模型,大鼠每日饮用0.02%氨水溶液,联合饥饱失常,即1 d禁止饮食,2 d过饱饮食;每周分别进行2次、3次灌胃(20 mmol/L脱氧酸钠溶液和2%水杨酸钠混悬液)。于造模后30 d后随机选取2只大鼠检测胃黏膜组织病理学,以胃黏膜组织的病理变化判断模型是否复制成功[8]。
1.4.2 分组与给药:将造模成功后的40只存活大鼠随机分为五组,分别为模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组,每组8只。另选取8只正常SD大鼠作为正常组。奥美拉唑组给予60 mg/kg奥美拉唑溶液3 ml灌胃,香仁胃舒汤高、中、低剂量组给予270、180、90 mg/kg香仁胃舒汤3 ml灌胃,1次/d,均连续灌胃4周。正常组和模型组提供等量0.9%氯化钠溶液连续灌胃4周。用药结束后麻醉大鼠,留取大鼠血清及胃黏膜组织观察指标。
1.5 观察指标
1.5.1 胃黏膜组织病理学变化及病理评分:取大鼠胃部组织,进行常规石蜡包埋,切片,用HE染色法分析其胃黏膜组织病理改变。分别将胃黏膜炎症、炎症变化、肠上皮化生、非典型增生及萎缩按无(0分)、轻度(1分)、中度(2分)、重度(3分)计分,将各个病理组织变化得分相加得到病理评分[9],同时记录胃体、胃窦黏膜组织病理评分。
1.5.2 血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β检测:用ELISA测定大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平,取大鼠血清,严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.5.3 胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表达:用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表达,按照BCA蛋白定量试剂盒对大鼠胃黏膜组织蛋白含量进行测定,制备凝胶,每个孔上样35 μg蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳,在室温条件下用5%脱脂奶粉密闭1 h,在4 ℃条件下孵育12 h一抗(浓度:JAK2和STAT3为1∶1000;P-JAK2、IL-8及IL-1β为1∶3000∶3000),在室温条件孵育二抗2 h,再加增强型化学发光试剂(ECL)使条带显影。
2.1 香仁胃舒汤对CNAG大鼠胃黏膜组织病理学变化及病理评分影响 见表1。正常组大鼠胃黏膜组织形态正常,腺体结构完整,分布少量炎性细胞。模型组大鼠胃黏膜组织边界不完整,黏膜层可见明显充血性水肿,伴有大量炎性细胞和淋巴细胞浸润渗出;治疗4周后,奥美拉唑组和香仁胃舒汤高剂量组大鼠胃黏膜组织形态基本正常,仅见少量炎性细胞渗出;香仁胃舒汤中剂量组大鼠胃黏膜组织边界较为完整,伴有少量炎性细胞渗出;香仁胃舒汤低剂量组大鼠胃黏膜组织边界较为完整,黏膜层可见轻度水肿,仍伴有较多炎性细胞渗出(图1)。与正常组比较,模型组胃体及胃窦黏膜组织病理评分均升高(P<0.05);与模型组比较,奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组评分均升高(P<0.05);与奥美拉唑组比较,香仁胃舒汤中、低剂量组评分均升高(P<0.05)。
表1 各组大鼠胃黏膜组织病理评分比较(分)
A:正常组;B:模型组;C:奥美拉唑组;D:香仁胃舒汤低剂量组;E:香仁胃舒汤中剂量组;F:香仁胃舒汤高剂量组
2.2 香仁胃舒汤对大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平的影响 见表2。与正常组比较,模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤各剂量组血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05);与模型组比较,奥美拉唑组和香仁胃舒汤各剂量组JAK2、STAT3、IL-1β水平均降低(P<0.05);与奥美拉唑组比较,香仁胃舒汤中、低剂量组P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05)。
表2 各组大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平比较
2.3 香仁胃舒汤对胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达水平的影响 见表3(图2)。与正常组比较,模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较高(P<0.05);与模型组比较,奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较低(P<0.05);与奥美拉唑组比较,香仁胃舒汤中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较高(P<0.05)。
表3 各组大鼠胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白相对表达水平比较
A:正常组;B:模型组;C:奥美拉唑组;D:香仁胃舒汤低剂量组;E:香仁胃舒汤中剂量组;F:香仁胃舒汤高剂量组
CNAG的病因病机复杂,尚未完全清楚其发病机制[10]。临床上可见胃黏膜充血水肿,伴有黏膜层大量浆细胞和淋巴细胞浸润,治疗效果不理想。中医诊治思想中的“未病先治,既病防变”在防止CNAG的发生发展有明显的优势。中医药在治疗CNAG方面有一定优势[11]。针对CNAG的发病绝大多数中医学者认为:饮食不节、素体虚弱、外邪、情志不畅等可致脏腑功能紊乱[12]。其病机为脾胃受损致胃失和降,脾失健运,脾胃纳运、升降的功能失调,气机郁滞,日久可表现为“气滞”“湿热”“血瘀”等虚实夹杂病理征象,从而使病情逐步恶化[13]。“脾胃升降失调”为CNAG及其癌前病变的发病根本,“邪在胃脘、久酿成毒”是CNAG及其癌前病变发生发展的重要因素,“脾虚络阻、虚实夹杂”为CNAG及其癌前病变的基本病机[14]。故脾失健运是CNAG病机演变的关键所在。脾胃虚弱,肝气不和,升降失调,治宜疏肝解郁,健脾和胃。香仁胃舒汤中党参、白术健脾益气;木香、砂仁、枳壳、厚朴等行气解郁;白芍、乌药行气柔肝止痛;沉香行气降逆;黄芩、蒲公英清热解毒;炙甘草补脾和胃,调和诸药。诸药合用,一升一降共奏调节气机之功,行气和胃[15]。
本研究通过构建大鼠模型,分别以不同剂量香仁胃舒汤给药。结果显示,香仁胃舒汤高剂量组能降低大鼠胃体及胃窦黏膜组织病理评分、血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平及胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达,起到调控细胞增殖、凋亡的作用。研究表明香仁胃舒汤可在一定程度上修复CNAG大鼠胃黏膜损伤,治疗效果良好。JAKs是一类蛋白酪氨酸酶,JAK2是其家族中的一员。STAT3在较多癌症中呈高表达。JAK2/STAT3信号通路可诱导细胞增殖、凋亡及免疫调节等,参与多种肠道炎性疾病及肿瘤的发生发展,其抑制剂可有效减缓疾病的发展,具有良好的临床疗效[16]。IL-1β为趋化因子家族中的一种细胞因子,不仅有较强的抑酸作用,还能促进IL-6的产生,是诱发CNAG的关键因素[17]。IL-8作为一种强力中性粒细胞趋化因子,IL-1β诱发的炎性细胞浸润很有可能是通过诱导以IL-8为代表的趋化因子而产生的[18]。IL-8可通过激活和趋化中性粒细胞使机体产生炎症反应,进一步使胃黏膜组织受损[19]。在病理状态下,大量IL-8、IL-1β与细胞膜上受体结合,导致细胞内JAK2大量聚集同时引起磷酸化,从而生成P-JAK2。P-JAK2通过激活细胞质内STAT3,使STAT3进入细胞核内,继而发生磷酸化,生成P-STAT3刺激下游信号因子,如IL-8、IL-1β等生成,介导细胞增殖、凋亡,加重炎性细胞浸润,加速炎症发展[20]。
综上所述,香仁胃舒汤对CNAG有一定的治疗效果,能改善胃黏膜组织损伤程度,降低P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平。其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路开放有关。中药复方汤剂是通过多靶点、多途径发挥治疗作用,香仁胃舒汤所用药味较多,故需在日后的研究中进行中药组分研究,明确香仁胃舒汤治疗CNAG的具体机制。