苦参素通过调控神经生长因子表达抑制背根神经节生长和疼痛递质释放研究

蒋 洁，任加强，王 铮，韩 亮

(1.西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西 西安 710061；2.陕西省人民医院肿瘤内科,陕西 西安710068)

近年，神经的生长、再生、退化与损伤修复，及其和肿瘤发生、发展的关系成为科学研究的热点，也是亟待解决的问题之一。苦参是一味常用传统中药，始载于《神农本草经》，为豆科植物苦参的干燥根茎。苦参味苦、性寒；归肝、肾、大肠、小肠、膀胱、心经；具有清热、燥湿、解毒、补中明目、养肝胆气以及利尿等功效。苦参素是一种广泛存在于苦参、苦豆子及广豆根等中草药中的具有四环喹嗪啶类结构的生物碱类成分[1-2]。苦参素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及镇痛、免疫调节等多方面的药理作用[3-4]。研究显示，苦参素对长春新碱引起的模型小鼠神经性疼痛的刺激具有保护作用[5]。苦参素通过抑制背根神经节中肿瘤坏死因子-α 的表达减轻神经性疼痛，且此过程是呈剂量依赖性方式的[6]。苦参素具有广泛的生物学活性[7-9]，但其在神经生长中的作用及其机制尚不明确。

背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)是周围神经系统的重要组成部分，主要由周围神经系统感觉神经元构成，接收机体的感觉信息，具有将疼痛、温度和压力等感觉刺激信号向中枢神经系统传递的功能[10]。DRG结构简单经典，体外DRG神经元模型被广泛应用于神经生长及体外髓鞘形成的现象、机制研究[11-12]。神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是最早被定义的神经营养因子。研究显示,NGF能刺激中枢和外周神经元的生长、发育、维持活力和诱导分化，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复[13]。研究显示，NGF 在组织中广泛表达，在多种类型的神经鞘和肿瘤细胞中呈高表达，可参与神经细胞的生存、分化和轴突形成等重要的过程[14]。本课题研究苦参素对神经生长和疼痛递质的表达影响和作用机制，从基础实验中探索苦参素对神经性疼痛的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本文用于提取背根神经节的实验动物为饲养于我校 SPF 级动物实验中心的 1 日龄的 Sprague-Dawley 大乳鼠，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。苦参素购自于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，应用DMEM培养基将其浓度稀释为20 μmol/L；人重组NGF购自美国Ρeprotech公司，应用DMEM培养基将其稀释至2 ng/ml。在背根神经节培养体系中分别加入苦参素(10 μmol/L)，定义为低浓度组；苦参素(20 μmol/L)，定义为苦参素组；苦参素(40 μmol/L)，定义为高浓度组；苦参素(20 μmol/L)联合应用外源性人重组NGF(2 ng/ml)，定义为苦参素联合NGF组；未干预组定义为空白对照组。神经节在含20%胎牛血清的F12培养基中，于5% CO2、37 ℃培养箱中常规培养。培养基购自Gibco公司。NGF、P物质(Substance P,SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)、内参GAPDH抗体以及二抗由Abcam公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 背根神经节的提取和培养:将新生大鼠浸入 75%乙醇内，麻醉消毒。麻醉成功后，将新生大鼠在平皿内呈俯卧位展平，从尾部正中剪开皮肤至枕部，切口两端向腹侧剪开，分离皮肤与肌层。从盆部横断脊柱躯干，剪至头部，小心去除内脏，保留脊柱及两侧肌肉骨骼为一整体。换至盛有预冷培养基的平皿，显微镜下修剪去除肌肉，勿损伤脊柱及两侧区域。从脊柱尾端入剪，沿侧壁剪开椎管并揭去，小心操作，避免损伤脊髓神经。轻轻提起脊髓一端，即可见两侧脊神经根，勾住脊神经根轻轻牵拉可见圆形背根神经节，显微镊夹住神经节侧端神经，可夹起。置于另一平皿中。按此法取出所有背根神经节。操作在冰浴过的PBS中进行，无菌原则及低温操作是成功提取神经节并保持其活性的要领。仔细修剪背根神经节两侧的神经节包膜及肌肉组织，轻轻撕去神经节外包膜，避免损伤。在培养皿滴入 20～30 μl预混的BD生物基质胶(Metrigel 胶和 DMEM/F12 培养基1∶1 预混)，胶内植入修剪妥当的神经节。培养箱内孵育1 h使胶凝固。加入 DMEM/F12 培养基，入细胞培养箱内培养。

1.2.2 背根神经节生长径的测量：应用神经节的生长径记录神经纤维的生长程度。具体方法为，通过倒置光学显微镜成像系统观察，以神经节胞体边缘为起始点，以其周围神经纤维的最末端为终点，将各个终点连接成线后即为神经纤维的生长范围。取神经生长范围的均值(“米字”线的均值)为神经节生长径。

1.2.3 实时定量PCR检测mRNA表达：提取细胞DNA参照操作说明。实时定量(RT) PCR反应条件：95 ℃预变性1 min后进入40个循环(95 ℃变性15 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸45 s)。用GAPDH作为正常对照，采用2-△△Ct法分析各个因子在细胞中mRNA的相对表达量。基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.3 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测分泌性蛋白的含量 分别将条件培养基和不同浓度干预的培养基吸取约100 μl加入相应孔中，每组样品设3个复孔。放入湿盒中，37 ℃孵箱孵育120 min。用洗涤液将反应板洗涤5次，滤纸上印干。在每孔中加入50 μl第一抗体工作液，混匀后放入湿盒中，37 ℃孵箱孵育60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，滤纸上印干。在每孔中加入100 μl酶标抗体工作液，混匀后放入湿盒中，37 ℃孵箱孵育60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，滤纸上印干。每孔加入100 μl底物工作液，混匀后37 ℃避光孵育10 min。每孔加入50 μl中止液混匀后在492 nm处测吸光值。根据标准品浓度得到标准曲线和回归方程，计算并获得待测样品目标分泌性蛋白的含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验,多组数据之间的比较使用单因素方差分析检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 背根神经节的鉴定 从新生大乳鼠的脊神经提取背根神经节。首先对神经节进行培养鉴定，鉴定方法为神经组织特异性蛋白S100免疫荧光染色(图1)。

A：光镜下观察提取的背根神经节形态；B：绿色荧光标记S100蛋白；

通过倒置光学显微镜成像系统可见中间近似圆形的部分为神经节，外周呈辐射状向外发散延伸的丝状结构包括神经轴索及施万细胞或其他神经胶质细胞。绿色荧光信号为神经组织特异性蛋白S100，轴索呈明亮的绿色丝状物，自神经节发出后呈放射状向外生长，神经丝向远端延伸性生长。蓝色荧光信号为DAPI标记的细胞核。可见大量神经胶质细胞的细胞核沿着神经节周围放射状排列。同时，神经节内部也有大量的细胞核重叠。将绿色荧光信号和细胞标记染色图像重合后，发现绿色荧光标记的神经组织主要在神经节的节内着色，这符合神经节的解剖和组织学特征。

2.2 苦参素抑制背根神经节的生长 见图2(表2)。应用苦参素干预体外培养的背根神经节，分别在干预0、24、48 h时间点检测苦参素(20 μmol/L)对神经节生长能力的影响。结果显示，同一干预时间段，苦参素组和空白对照组比较，能明显抑制神经节生长径(P<0.05)。

A：空白对照组；B：苦参素组

表2 不同时间点苦参素对神经节生长能力影响的比较(μm)

2.3 苦参素抑制培养体系中背根神经节NGF和疼痛递质的表达和分泌 见表3、4。在背根神经节培养体系中加入不同浓度的苦参素培养48 h后，应用Real-time PCR检测神经节中NGF和疼痛递质SP、CGRP mRNA的表达；应用ELISA检测培养体系上清中NGF和疼痛递质SP、CGRP的分泌量。结果显示，随着苦参素浓度升高，背根神经节中NGF和疼痛递质SP、CGRP mRNA的表达量逐步降低(P<0.05)。同时ELISA结果显示，随着苦参素浓度升高，培养上清中NGF和疼痛递质SP、CGRP的分泌量逐步减少(P<0.05)。可见苦参素可抑制培养体系中背根神经节NGF、SP和CGRP的表达和分泌。

表3 不同浓度苦参素对NGF、SP和CGRPmRNA表达影响的比较

表4 不同浓度苦参素对NGF、SP和CGRP分泌量影响的比较

2.4 苦参素通过抑制NGF延缓背根神经节生长 计算培养24 h的神经节生长径。观察各组中神经节生长能力的变化(图3)。结果显示，苦参素联合NGF组、苦参素组、空白对照组的神经节生长径分别为(16.24±0.28)μm、(10.30±0.52)μm、(17.48±0.42)μm，苦参素联合NGF组与苦参素组比较，能明显促进神经节生长径(P<0.05)。可见NGF能够逆转苦参素延缓背根神经节的生长。

A：空白对照组；B：苦参素组；C：苦参素联合NGF组

3 讨 论

多项研究已经证实，周围神经损伤后在神经修复再生过程中，可诱发以痛觉过敏为特征的神经性疼痛，在痛觉过敏期间，有害刺激可引起严重的疼痛。对于神经性疼痛，西医首选采用药物治疗，包括钙离子通道调节剂(加巴喷丁、普瑞巴林等)、三环类抗抑郁药(如阿米替林)、阿片类药物(吗啡、羟考酮等)和曲马多等，严重时也可选用外科手术治疗(神经阻滞或毁损术、脊髓电刺激术、运动皮层电刺激、脑深部电刺激术等)，但是以上治疗往往效果不理想且患者对治疗耐受性差，易出现药物不良反应及耐药。

苦参在全国各地均有分布，植物的干燥根为其入药部位，《滇南本草》及《神农本草经》均记载其具有清热燥湿、凉血、解热毒、疥癞、除痈肿等功效，对各种热痛有一定缓解作用。苦参素作为中草药苦参的提取物及主要成分，近年来在心血管系统疾病、感染性疾病及抗肿瘤的临床应用逐步得到认可并成为研究热点[15-17]。研究显示，苦参素有较明显的镇静和镇痛作用，动物研究显示其能减少小鼠自发活动，拮抗苯丙胺所致的兴奋，加强水合氯醛和氯丙嗪等药物的抑制作用，对各种化学及热刺激均有较明显镇痛效果。同时还有研究显示苦参素镇痛作用与背根神经节炎症因子的表达等有关[18-19]。在临床实践中也已经证明其存在镇痛作用[20]。但是，目前关于苦参素镇痛作用的具体机制研究仍较少。

本实验借助体外提取背根神经节，通过苦参素干预神经节的培养体系，发现苦参素能够抑制背根神经节的生长能力，且能够抑制NGF的表达和分泌。同时，苦参素能够抑制疼痛递质SP、CGRP的表达与分泌。当应用NGF与苦参素联合干预后，神经纤维的生长能力较单纯应用苦参素干预组明显改善。可见苦参素能通过抑制NGF减缓神经生长。本研究提示了苦参素对神经性疼痛镇痛作用的可能机制，丰富了苦参素镇痛作用的理论基础。

神经和疼痛的载体是人体或动物，本实验为体外实验，在体外模拟神经的生长和疼痛存在一定的局限性。因此在后续的实验中，课题将在体内构建动物神经损伤模型，通过动物行为学检测疼痛行为变化和血清中疼痛递质的释放来进一步验证体外实验结果。