杂环酰胺类HPPD抑制剂的生殖毒性初探

孙雪婷，李国伟，华文浩，李瑞士

（南通海关，江苏 南通 226299）

在动植物体内生命代谢活动中具有很多相同的酶，在不同物种体内发挥着不同的作用。如4-羟苯基丙酮酸双氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD）参与了酪氨酸(Tyrosine)代谢，但大多数生物体内前两步代谢是相同的，即生物体内的酪氨酸在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase，TAT)的作用下生成对羟基苯基丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HPP），HPPD 进一步催化HPP 转化为尿黑酸（2,5-dihydroxyphenylacetate,HGA）[1]。之后则根据物种不同分化出不同的代谢途径，如分成哺乳动物、植物及微生物代谢等。

在人体内，HPPD 同样也发挥着重要的生理功能，参与人体的酪氨酸和苯丙氨酸分解代谢。若酪氨酸的代谢过程受损，将产生一系列酪氨酸血病。Ⅰ型酪氨酸血症是一种因延胡索酰乙酰乙酸酶缺乏引起酪氨酸代谢异常。其主要症状是肝功能衰竭、肝硬化，最终导致肝癌[2]。可喜的是，1992年，研究发现尼替西农（2-(2-nitro-4-trifloromethylbenzoyl)-cyclohexane-1,3-dione，NTBC）可通过抑制HPPD 的活性进而阻断酪氨酸代谢通路，该酶的抑制剂NTBC 临床上已经应用于治疗酪氨酸病。该药由瑞典Swedish Orphan 公司推出，于2002年4月开始在美国上市，对患有Ⅰ型酪氨酸血症及尿黑酸尿症病人有较显著的疗效，可明显减轻对肝脏、肾脏和心脏的毒害症状[3]。

在植物体内，如果对羟苯基丙酮酸（HPP）转化为尿黑酸（HGA）的过程被抑制，导致质体醌和生育酚的合成受阻[4-5]。质体醌和生育酚是光合作用中电子传递所需要的重要物质。其中，生育酚是植物生长所必须的抗氧化剂；此外，质体醌还是八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因素，质体醌的减少使八氢番茄红素去饱和酶的催化作用受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成。质体醌是光合作用中电子传递的关键辅因子，它使电子从光合系统Ⅱ到达光合系统Ⅰ，从而将光能转变为化学能，而类胡萝卜素则保护植物免受日光的伤害。类胡萝卜素既可作为光吸收体，又可作为保护性物质，降低三线态叶绿体或单线态氧的激发，胡萝卜素的生物合成被抑制，出现白化症状，最终将导致植物最终死亡[6-7]。据此，很多HPPD 类除草剂已被商业化，如先正达公司于2001年上市的硝磺草酮在全球范围内广泛使用，其2019年销售额高达7.8 亿美元[8]。

最近，先正达公司吡唑萘菌胺因生殖毒性被欧盟撤销登记，引起了人们对农药分子生殖毒性的广泛关注。HPPD 在动植物体生命活动中均发挥着重要的作用，无论是医药领域还是农药领域，世界各大公司都一直在进行深入研究。在农药中，拜耳公司在专利WO2015135946A1 中报道了一种新型杂环酰胺类化合物，其在作用机制上也属于HPPD 抑制剂类除草剂[9]。本文从拜耳公司的专利 WO 2012126932A1 中选取一个列表化合物[10]，编号为2-235（本文中的CP531），来研究这种新型HPPD类抑制剂在动物体内代谢以及对动物体的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

由辽宁长生生物科技有限公司提供 SPF 级C57BL/6 雌性小鼠，体重18～25 g。所有小鼠染毒前适应性喂养及检疫一周，均在SPF 级动物房饲养，控制相对湿度为50%～70%，温度为（23±2）℃，明暗周期为12 h∶12 h，自由进食饮水，所有动物处理均按照动物机构伦理委员会的指导执行。

1.1.2 主要试剂与仪器

BCA 蛋白定量试剂盒，Solarbio 公司；重组Anti-G-protein coupled receptor 30 抗体，美国abcam公司；Estrogen Receptor alpha 抗体（D-12），美国santa 公司；Estrogen Receptor beta 抗体，美国Gene Tex 公司；β-actin 单克隆抗体，美国abcam 公司；ECL 显影液，美国Millipore 公司；蛋白Marker，美国thermo 公司；RIPA 蛋白裂解液，上海碧云天公司；PMSF，上海碧云天公司；过硫酸胺（ammonium persulfate,APS），上海碧云天公司；脱脂奶粉，Solarbio 公司；HE 染色试剂盒，Solarbio 公司；电镜固定液，武汉赛维尔公司；30%聚丙烯酰胺，Solarbio公司；姬姆萨染液，Solarbio 公司；ELISA 试剂盒，Elabscience 公司；PVDF 膜，美国Millipore 公司；一抗稀释液，上海碧云天公司；二抗稀释液，上海碧云天公司；甘氨酸，上海碧云天公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），上海碧云天公司；十二烷基苯磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate,SDS），上海碧云天公司。

环氧树脂包埋套装，北京中镜科仪技术有限公司；醋酸双氧铀，北京中镜科仪技术有限公司；凝胶成像分析系统，美国Bio-red 公司；电泳仪，美国Bio-red 公司；转膜夹，美国Bio-red 公司；全波长酶标仪，美国thermo 公司；倒置显微镜，日本NiKon公司；透射电子显微镜，日本JEOL 公司；全自动脱水包埋一体机（YB-6LF），孝感市亚光医用电子科技公司；莱卡旋转式超薄切片机（M2135），德国莱卡公司；莱卡摊片机（HI1210），德国莱卡公司；莱卡烘片机，德国莱卡公司；台式低温水平离心机（TDL-5000bR），上海安亭科学仪器厂。

1.1.3 主要试剂配制

1）70%乙醇：取70 mL 无水乙醇，加入30 mL高压灭菌后的纯水，于常温保存备用。

2）80%乙醇：取80 mL 无水乙醇，加入20 mL高压灭菌后的纯水，于常温保存备用。

3）90%乙醇：取90 mL 无水乙醇，加入10 mL高压灭菌后的纯水，于常温保存备用。

4）95%乙醇：取95 mL 无水乙醇，加入5 mL高压灭菌后的纯水，于常温保存备用。

5）1×PBS 缓冲液：取出一小袋PBS 粉末溶于双蒸水（900 mL），普通玻璃棒辅助搅拌使其溶解充分，添加双蒸水补足终末体积为1 000 mL，调整pH 值为7.2～7.4。

6）10×电泳液：称取甘氨酸144 g，Tris 30 g，SDS 10 g，全部加入到三蒸水（900 mL）中至完全溶解，继续加入三蒸水补足终体积1 000 mL。临用前需加三蒸水稀释为1×电泳缓冲液即可。

7）10×电转液：称取甘氨酸144 g，Tris 30.3 g，全部加入到三蒸水（900 mL）中至完全溶解，继续加入三蒸水补足终体积1 000 mL。临用前按三蒸水∶甲醇∶10×电转液=7∶2∶1 的体积稀释为1×电转液即可。

8）10%过硫酸胺（APS）：将过硫酸胺（1 g）充分溶于三蒸水（10 mL）配置成质量分数为10%过硫酸胺待用。

9）5%脱脂奶粉：称取脱脂奶粉（0.5 g）溶解于新鲜1×TBST（10 mL）溶液中，充分溶解后待用。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组、染毒及处理

根据预实验结果设置以下组别：对照组（玉米油溶剂）、CP531 低剂量组（14 mg·kg-1）、CP531 中剂量组（68 mg·kg-1）、CP531 高剂量组（340 mg·kg-1）。采取每日同一时间段染毒，分别持续灌胃染毒28 d和90 d，灌胃体积均为10 mL·kg-1（化合物溶于玉米油）。染毒期间密切观察小鼠染毒后症状及生长发育情况，每日灌胃前记录小鼠体重计算染毒前后体重增长并调整灌胃剂量。

所有小鼠于末次染毒后禁食不禁水12 h，眼球取血，收集血液标本于非抗凝管中，放置2～3 h，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清放入-80 ℃冰箱，用于测定小鼠血清中激素水平；取血后迅速分离、采集小鼠子宫、卵巢并清除表面结缔组织，脏器表面血污用生理盐水洗净，多余水分用滤纸吸干，精确称量脏器湿重，脏器系数以脏器湿重（g）/100 g动物体重来表示；之后每组取小鼠子宫和卵巢组织于4%多聚甲醛中进行固定用于病理检查；取小鼠子宫和卵巢剪切成约0.1 cm3组织，于电镜固定液中固定用于透射电镜检查；4 ℃保存待用；其余分装并迅速转入-80 ℃冰箱保存，用于后续蛋白水平测定。

1.2.2 阴道脱落细胞采集

采用生理盐水冲洗法于小鼠处死前10 d每日固定时间段，预先将生理盐水倒入一次性平皿中，将所需的载玻片毛玻璃端提前标记好编号。左手固定小鼠，将小鼠仰卧于手中，用10 μL 移液枪吸取无菌生理盐水后插入小鼠阴道内约2～3 mm 处，打入生理盐水并抽吸1～2 次，观察液体变浑浊后即可，涂于载玻片一端，自然风干。注意不要插入太深，温和的操作可以避免引发炎症反应。随后浸泡在95%的乙醇溶液中固定15～20 min，室温下晾干后进行吉姆萨染色（8～10 min），最后在光镜下观察细胞形态，按照雌性小鼠动情周期判断标准确定其不同阶段：动情前期（proestrus，P）、动情期（estrus，E）、动情后期（metaestrus，M）、动情间期（anestrus，A）。动情周期判断标准见表1。

表1 雌性小鼠动情周期判断标准

1.2.3 ELISA 检测CP531 化合物染毒小鼠血清激素水平

根据ELISA 试剂盒说明书检测小鼠血清中雌二醇激素（Estradiol，E2）、促黄体生产素（Luteinizing hormone，LH）、孕酮（Progesterone，P）、促卵泡生产激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）的分泌水平。

1）使用前取出-80 ℃中冻存备用的血清，于常温解冻。

2）设空白孔、标准品孔、待测样品孔在已包被抗体的酶标板。

3）用封板膜密封酶标板，37 ℃孵育指定时间后甩尽酶标板内的液体。

4）加入生物素化抗体工作液，封板膜密封酶标板，37 ℃孵育一定时间。

5）孵育完成后，甩尽孔内液体，在干净的吸水纸上拍干，然后每孔用1×洗涤缓350 μL 冲液洗涤酶标板1 min，甩掉酶标板内的液体，拍干，重复此步骤3 次。

6）每孔加入100 μL 酶结合工作液，封板膜密封酶标板，37 ℃孵育一定时间。

7）甩尽孔内液体，洗板5 次。

8）每孔加入底物溶液（TMB）90 μL，置于37℃避光孵育15～30 min。当标准孔出现明显梯度时（前4 个显色孔出现明显蓝色梯度），即可终止。

9）每孔加入终止液50 μL，终止反应，蓝色立即变成黄色。

10）立即用酶标仪在波长450 nm 测定各孔的光密度（OD）值，根据标准曲线计算各血清样品的浓度。

1.2.4 HE 染色检查CP531 化合物对卵巢、子宫组

织病理学改变

1）脱水、包埋：将于4%多聚甲醛固定好的卵巢、子宫组织，按顺序放入70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精中分别脱水，然后分别置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明40 min，用液体石蜡将其包埋后制备成蜡块，冷却凝固后备用。

2）切片贴片：用石蜡切片机将包埋好的小鼠卵巢、子宫石蜡块切成厚度约为5μm 的切片，置于45 ℃水浴中待小鼠卵巢、子宫组织完全摊平后捞取切片，避免褶皱，置于37 ℃烘干箱中至水分烘干。

3）HE 染色：按照顺序把切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别5 min 进行脱蜡，100%酒精Ⅰ、Ⅱ、95%、80%、70%酒精各5 min 进行脱水，后用流水一过性冲洗；苏木精染核5 min，流水轻轻冲洗，稀盐酸分化液分化3～5 s，流水冲洗反蓝，伊红染色3 min，依次放进70%、80%、95%、100%酒精和二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 s 进行脱水透明。脱水透明完成后将载玻片取下，滴加1～2 滴中性树胶封片，室温下保存。

4）显微镜下观察拍照并分析组织病理学变化。

1.2.5 透射电镜检测CP531 化合物对卵巢、子宫超微结构的影响

1）取电镜固定液固定好的卵巢、子宫组织，经30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的丙酮逐级脱水，其中在100%的丙酮中脱水3 次。

2）将脱水后的卵巢、子宫先后经过比例为3∶1、1∶1、1∶3 的脱水剂和环氧树脂渗透液，每步约30～60 min。完成后放入适当的磨具中，灌上包埋液经过加温聚合形成包埋块，备下一步切片。

3）采用超薄切片机制备约50 nm 厚的超薄切片，漂浮于刀槽页面上，再捞至铜网。分别使用醋酸铀和枸橼酸铅室温下染色15～20 min。

4）使用JEM-1400PLUS 透射电镜观察卵巢、子宫细胞形态及超微结构并拍照。

1.2.6 Western blot 检测CP531 化合物对卵巢、子宫雌激素受体相关蛋白表达的影响

1）卵巢、子宫组织总蛋白的提取：-80 ℃冰箱中取出约25 mg 的组织，加入适量的组织裂解液（每100 μL 的裂解液含1 μL 的PMSF），加入2颗研磨珠，充分研磨后置于冰上裂解1 h，4 ℃，12 000 r·min-1，离心5 min。取离心后上清至EP 管中即为细胞总蛋白，-80 ℃冰箱中保存待用。

2）蛋白浓度的测定：从-80 ℃冰箱中取出已提取的细胞总蛋白，室温解冻。按照说明书将标准品按0，2，4，8，12，16，20 μL 加入96 孔板中配制标准系列，各孔加PBS 补足20 μL。设置样品孔，分别加入稀释好的样品20 μL，每个样品设3个复孔。向各标准孔及样品孔中加200 μL BCA 工作液（BCA∶Cu=50∶1），37 ℃孵育30 min，用酶标仪于562 nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算待测样品蛋白浓度。根据样品蛋白浓度，使用PBS、1×上样buffer 调整各样品浓度，放入100 ℃的蛋白变性仪10 min，使蛋白充分变性，-80 ℃冰箱中保存待用。

3）制备SDS 聚丙烯酰胺凝胶：安装固定清洁的玻璃板于配胶装置中，根据目的蛋白分子量大小选择相应浓度的分离胶进行制胶，用移液枪将制备好的分离胶溶液小心的加入两块玻璃板的间隙中，直至液面达到绿色带中间线高度后，在胶上面加入一层无水乙醇压胶及隔离空气。待分离胶完全凝固后倒掉无水乙醇，接着再分离胶上加满浓缩胶，立即插上梳子，静止完全凝固后轻轻竖直向上拔出梳子并加入电泳液。

4）SDS-PAGE 凝胶电泳及转膜：按实验分组顺序依次向加样孔中加入蛋白Marker 和已制备好的蛋白样品（上样体积为10 μL）。连通电源，先用90 V 稳压电泳，使样品压成一条线且蛋白Marker开始分离后，将电泳电压换成120 V 继续电泳，待溴酚蓝跑到分离胶底部即可终止电泳。电泳即将结束半小时前，预先准备好PVDF 膜（用甲醇活化）、转膜夹等，并将其浸泡在预冷的转膜液中。电泳结束后小心剥出凝胶，依次按照（负极）海绵垫、凝胶、PVDF 膜、海绵垫（正极）的顺序装好在电转夹中，同时加入预冷的转膜液以及冰块，根据目的蛋白的分子量，调整合适的转膜条件即可。

5）封闭、孵育抗体、显影：转膜结束后，根据目的蛋白分子量大小将PVDF 膜相应蛋白Marker 处剪下，完全浸泡在含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中，置于摇床上缓慢水平摇动，室温封闭2 h。封闭结束后转入TBST 溶液中，置于摇床上漂洗3 次×10 min·次-1，结束后放入配好的一抗中，放4℃冰箱中孵育过夜。次日取出PVDF 膜，用TBST 溶液漂洗3 次×10 min·次-1后，再放入相应的二抗溶液中，摇床缓慢摇动室温孵育1 h，用TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min。最后将PVDF 膜放在显影机上，将配置好的显影液均匀的滴到膜上，采用Bio-Rad 凝胶成像系统进行图像采集和条带分析。各目的蛋白与内参蛋白β-actin 条带灰度值的比值为各蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 确定染毒剂量

根据霍恩法检测CP531 急性毒性，用半数致死剂量（Median lethal dose，LD50）表示，通过实验得出CP531 两种化合物LD50 为6 810 mg·kg-1。对照农药毒性评判标准判定以上化合物质属低毒类。根据亚慢性毒性试验剂量选择要求和研究分别设化合物高剂量组为340 mg·kg-1（1/20 LD50），再以5倍组距设中、低剂量组分别为68 mg·kg-1（1/100 LD50）、14 mg·kg-1（1/500 LD50）。使用体表面积（BSA）标准化方法计算得出本研究中使用的CP531 化合物剂量的人等效剂量（HED）分别为低剂量：1.14 mg·kg-1；中剂量为：5.51 mg·kg-1；高剂量为：27.57 mg·kg-1。

2.2 CP531 化合物短期（28 d）和长期（90 d）染毒未出现严重的系统毒性

C57BL/6 小鼠经适应性喂养后按体重进行随机分组，分为对照组、CP531 低剂量组、CP531 中剂量组、CP531 高剂量组。灌胃染毒28 d 和90 d。在染毒过程中未出现小鼠死亡及严重的中毒现象。于28 d 和90 d 取材前进行体重称量。结果显示在目前剂量下，无论是短期还是长期染毒均不会对小鼠体重产生明显影响（图1），提示CP531 短期和长期染毒不会产生严重的全身系统毒性。

2.3 CP531 化合物短期（28 d）和长期（90 d）染毒对卵巢和子宫脏器系数影响

脏器系数是实验动物某脏器的重量与其体重之比，又称脏体比。脏器系数是毒理实验中常用的指标。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。通过数据统计，发现在目前的染毒剂量下，CP531 短期重复剂量染毒（28 d）有降低卵巢和子宫脏器系数的趋势（图2），意味着短期染毒CP531有可能引起卵巢和子宫的萎缩及退行性改变的趋势。其中，CP531 染毒中剂量组和高剂量组卵巢脏器系数显著低于对照组（P＜0.05）。

2.4 CP531 化合物染毒改变小鼠动情周期

在实验动物处死前10 d，通过每日阴道涂片，进行吉姆萨染色观察小鼠动情周期变化情况。通过观察和统计分析，结果显示，对照组小鼠动情周期为4～5 d，而CP531 化合物染毒28 d、90 d 后雌性小鼠动情周期明显延长。其中CP531 染毒28 d 后，高剂量染毒后的动情周期显著长于对照组（图3，P＜0.05）；CP531 染毒90 d 后，中、高剂量染毒后的动情周期显著长于对照组（图3，P＜0.05）；动情周期变化提示机体内激素分泌紊乱，动情周期长期紊乱会导致生殖功能障碍。

2.5 CP531 化合物染毒改变促性腺激素分泌情况

动情周期提示体内激素水平变化，因此，进一步探究CP531 化合物对性腺激素的影响。染毒时间截止后，行眼球摘除术取全血，全血离心分离血清，测定雌二醇激素（Estradiol，E2）、促卵泡生产激素（Follicle-stimulating hormone，FSH ）、孕酮（Progesterone，P）、促黄体生产素（Luteinizing hormone，LH）水平变化。经过28 d 染毒，CP531高剂量组E2 水平显著增加（图8，P＜0.05）。经过90 d 染毒，CP531 中、高剂量组E2 水平显著下降（图8，P＜0.05）。激素长期紊乱可能引起生殖异常，增加生殖系统肿瘤发生几率等严重后果。

经过28 d 染毒，CP531 染毒组FSH 水平显著增加（图9，P＜0.05）。经过90 d 染毒，CP531 染毒组FSH 略下降，差异无统计学意义。

经过28 d 染毒，CP531 高剂量组P水平显著降低（图10，P＜0.05）。经过90 d 染毒，CP531 低剂量染毒组P水平显著增加。

经过90 天染毒，CP531 中剂量染毒组LH 水平显著增加（图11，P＜0.05）。

2.6 CP531 化合物染毒对卵巢和子宫组织影响

卵巢是雌性动物和女性重要的性腺器官，对机体的各种性激素起着重要的调节作用。卵巢HE 染色，镜下发现，对照组小鼠卵巢各级卵泡可见，生长卵泡透明带明显，颗粒细胞丰富，排列整齐紧密，闭锁卵泡数量较少。28 d CP531 染毒组小鼠卵巢各级卵泡均可见，但随着染毒剂量的增加，出现颗粒细胞排列紊乱、透明带分界模糊，闭锁卵泡数量较多。随着卵巢发育，90 d 各个组闭锁卵泡较28 d 小鼠卵巢少，但随着染毒剂量的增加，90 d CP531 染毒组出现颗粒细胞排列紊乱、脱离，透明带边界模糊。CP531 染毒28 d 染毒影响较90 d 严重，可能是由于早期卵巢发育对CP531 更敏感，随着卵巢发育成熟，激发修复机制。

子宫是雌性动物和女性重要的生殖器官，子宫HE 染色，各个组总体上腺体丰富，子宫结构完整。28 d CP531 染毒组子宫上皮细胞变薄，炎性细胞增加。CP531 染毒组有脱落子宫蜕膜组织。90 d 各组腺体丰富，CP531 染毒组有脱落子宫蜕膜组织，上皮细胞排列不整齐，少量炎性细胞浸润。

2.7 CP531 化合物染毒对卵巢和子宫超微结构的影响

进一步观察各个染毒时间点细胞超微结构病理变化，28 d 透射电镜观察发现CP531 染毒组随着染毒剂量增加颗粒细胞排列越紊乱，高剂量组透明带不完整，颗粒细胞脱落，细胞质减少。

90 d 透射电镜观察发现对照组透明带清晰，颗粒细胞排列紧密。CP531 染毒组颗粒细胞排列疏松，细胞间间隙增大，核质固缩。

28 d 子宫透射电镜观察发现CP531 染毒组部分子宫上皮细胞核固缩，形态不规则。

90 d 子宫透射电镜观察发现CP531 染毒组中剂量组和高剂量组部分子宫上皮细胞核固缩，形态不规则。

2.8 CP531 化合物染毒对卵巢和子宫雌激素受体表达的影响

雌二醇通过与细胞核膜上的雌激素受体ERα、ERβ结合，介导下游基因转录，在神经系统、免疫系统、心血管系统以及生殖系统发挥重要调节作用。GPER 是一种非基因组受体，GPER 可与雌二醇结合，可发挥快速信号传递作用，调控下游信号通路。经典雌激素受体（ERα、ERβ）与非经典雌激素受体（GPER）对卵巢和子宫功能非常重要。实验结果显示CP531 化合物染毒28 d 与90 d 后卵巢雌激素受体表达增加（图18）。

对子宫组织雌激素受体蛋白表达水平检测发现CP531 化合物染毒28 d 与90 d 后雌激素受体表达增加。从结果中可发现CP531 中、高剂量染毒可明显增加子宫ERα、ERβ、GPER 表达水平，提示CP531对子宫激素受体干扰效应更明显（图19）。

3 结果与讨论

本文的实验结果表明：CP531 化合物短期（28 d）和长期（90 d）染毒会干扰雌性小鼠卵巢和子宫功能，具有一定生殖毒性。与子宫相比，雌性小鼠卵巢对CP531 化合物更敏感，更易受到CP531 化合物影响。需Ⅱ、Ⅲ段生殖毒性实验进一步评估CP531化合物对子代发育的影响。杂环酰胺是一类结构较新颖的HPPD 类抑制剂，虽然具有较高的除草活性，但其对哺乳动物的安全性尤其是对雌性生殖毒性值得高度关注，或许这是该类抑制剂一直没有实现商品化的主要原因。