紫花地丁抑制HAGLR对前列腺癌细胞凋亡、侵袭及迁移的影响

郑传痴 何国平 陈宗平

(遵义医科大学第二附属医院 1药剂科，贵州 遵义 563100；2肿瘤科；3遵义医科大学附属医院泌尿外科)

前列腺癌是男性致死性癌症中第二大癌，我国前列腺癌的发病率逐年升高，前列腺癌后期往往发展为去势抵抗型前列腺癌及全身多处转移，使得治疗困难〔1〕。试验证明，中国传统医药在前列腺癌中已显现出独特的优势，许多中药提取物可以发挥抗前列腺癌的效果〔2〕。紫花地丁为堇菜科堇菜属多年生草本植物，是中医治疗过程中应用较为广泛的一种中药材，其含有多种化学成分，具有广泛的药理作用，如抗炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等〔3〕。研究报道紫花地丁全草水提物能够降低乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2的细胞活力，抑制癌细胞且能诱导癌细胞凋亡〔4〕。紫花地丁对U14荷瘤鼠肿瘤组织生长具有明显的抑制作用〔5〕。然而紫花地丁对前列腺癌细胞凋亡、侵袭及迁移的影响及其机制尚不清楚。长链非编码(lnc)RNA已被证明在包括前列腺癌在内的各种类型的癌症中异常表达，因此，lncRNA可作为前列腺癌的新型生物标志物和治疗靶标〔6〕。同源盒D基因簇反义生长相关的长链非编码RNA(HAGLR)也称HOXD-AS1，研究报道HAGLR在前列腺癌组织中的表达水增高，与患者预后密切相关〔7〕。HOXD-AS1可促进前列腺癌的增殖，去势抵抗和化学抵抗；敲低HOXD-AS1可以在体内和体外抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖和化学耐药性〔8〕。HOXD-AS1在神经胶质瘤组织和神经胶质瘤细胞系中上调表达；敲低HOXD-AS1抑制神经胶质瘤细胞迁移和侵袭〔9〕。本实验旨在研究紫花地丁可能通过调控HAGLR对前列腺癌细胞凋亡、侵袭及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料 细胞DU145购自上海冠导生物；DMEM培养基购自上海善然生物；MTT试剂盒、凋亡试剂盒购自日本同仁化学研究所；紫花地丁购自中国药品生物制品检定所；Transwell、Matrigel购自美国BD公司；荧光定量PCR试剂盒购自武汉科昊佳生物；RIPA蛋白裂解液购自北京康佳宏原生物；N-钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)3抗体购自英国biorbyt公司。

1.2细胞处理与分组 DU145细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。取对数期细胞，用紫花地丁20、40、80 μg/ml处理，为低、中、高剂量组，正常培养的细胞作对照组。将si-NC、si-HAGLR转染DU145细胞，分别为si-NC组、si-HAGLR组。

1.3MTT检测细胞活性 培养48 h各组细胞，按试剂盒操作，酶标仪490 nm处检测吸光度(OD)值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 培养48 h各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗按试剂盒操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 各组细胞制成细胞1×104个/ml细胞悬液，取100 μl接种上室，培养24 h，经甲醛固定、结晶紫染色，显微镜下拍照并计数。细胞侵袭实验上室加入Matrigel，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。

1.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测HAGLR表达水平 各组细胞提取总RNA，反转录cDNA行PCR扩增，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。GAPDH为内参，HAGLR上游引物：5′-GGGAACCTCCAGAGATGACA-3′，下游：5′-CGGCTGACATTAGCTTCCTC-3′。

1.7Western印迹法检测N-cadherin、E-cadherin、Cleaved-caspase3蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，定量；进行电泳、转膜、封闭；加一抗4℃孵育过夜，加二抗室温孵育2 h，暗室曝光、定影；Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行t检验，单因素方差分析。

2 结 果

2.1紫花地丁对DU145细胞活性和凋亡的影响

中、高剂量组细胞OD值较对照组显著低，凋亡率较对照组显著高(P<0.05)；而低剂量组细胞OD值和凋亡率与对照组差异不显著(P>0.05)，见图1，表1。

图1 紫花地丁促进DU145细胞凋亡

表1 紫花地丁抑制DU145细胞活性，诱导细胞凋亡及对DU145迁移侵袭的影响

2.2紫花地丁对DU145迁移侵袭的影响 中、高剂量组迁移、侵袭细胞数较对照组显著低(P<0.05)；而低剂量组迁移、侵袭细胞数与对照组差异不显著(P>0.05)，见表1。

2.3紫花地丁对DU145中HAGLR表达的影响 与对照组相比，中、高剂量组HAGLR表达水平显著降低(P<0.05)；而低剂量组无明显变化。见表1。

2.4干扰HAGLR对DU145细胞活性及凋亡的影响 与si-NC组相比，si-HAGLR组细胞OD值显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，见图2，表2。

2.5干扰HAGLR对DU145迁移侵袭的影响 与si-NC组相比，si-HAGLR组迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)，见表2。

2.6紫花地丁处理及干扰HAGLR对DU145中蛋白表达的影响 与对照组相比，中、高剂量组N-cadherin表达水平显著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表达水平升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)；而低剂量组各蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)；与si-NC组相比，si-HAGLR组N-cadherin表达水平显著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表达水平升高(P<0.05)，图3，表3。

图2 干扰HAGLR可促进DU145细胞凋亡

表2 干扰HAGLR对DU145细胞活性、凋亡、迁移、侵袭的影响

1～6：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、si-NC组、si-HAGLR组图3 N-cadherin，E-cadherin和cleaved-caspase 3蛋白表达水平

表3 紫花地丁处理及干扰HAGLR对DU145蛋白表达的影响

3 讨 论

研究显示，中药提取成分对前列腺癌细胞具有抗肿瘤作用，其治疗前列腺癌具有巨大的潜力和发展空间〔10，11〕。研究报道紫花地丁提取物可以抑制高度转移性人类肺癌细胞系A549细胞的侵袭〔12〕。紫花地丁改善了脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤〔13〕。本实验表明中、高剂量紫花地丁可抑制前列腺癌细胞DU145增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡；而低剂量的紫花地丁对前列腺癌细胞无影响。

已有研究表明HAGLR与前列腺癌的增殖及预后相关〔7，8〕。且研究报道HOXD-AS1在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中过表达，其高表达与临床晚期，肿瘤大小，淋巴结转移和远处转移有关；降低HOXD-AS1抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，迁移和侵袭，并促进细胞周期停滞〔14〕。HOXD-AS1高表达促进卵巢癌细胞增殖，迁移和侵袭〔15〕。食管癌组织和细胞中HAGLR表达增加，下调HAGLR通过使miR-143-5p海绵化而抑制溶酶体相关膜糖蛋白(LAMP)3表达，从而抑制细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化(EMT)和肿瘤生长〔16〕。沉默HOXD-AS1可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞周期阻滞〔17〕。本实验提示，干扰HAGLR表达可抑制前列腺癌细胞DU145增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。本实验提示紫花地丁可能通过下调HAGLR抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭及迁移，促进细胞凋亡。