外源褪黑素对镉胁迫下棉苗生长及光合特征的影响

黄沛域，卢玉姗，张广兴，牛继梦，孙晓雪，袁欣彤，贾雨杉，平文超，孙红春，张永江，刘连涛*

（1. 河北农业大学农学院/ 河北农业大学作物生长调控实验室，河北 保定 071000；2. 沧州市农林科学院/ 河北省农作物耐盐碱评价与遗传改良重点实验室，河北沧州 061001）

镉（Cadmium,Cd）是自然界中广泛存在的一种重金属微量元素，它不参与生物有机体的结构组成和代谢活动，对动植物都是非必需的剧毒重金属元素[1]。 Cd 在土壤- 植物系统中的迁移性较为活跃，易被根系吸收，并转移到地上部，积累到生殖器官；它不仅严重影响作物的产量和品质，而且可以通过食物链进入人体并具有可积累性，达到一定剂量会影响人体健康[2]。近年来，随着化肥、农药施用和污水灌溉等活动，土壤Cd 污染日益严重，全国Cd 的点位超标率达到7.0%，成为影响我国农产品品质的主要重金属污染物[2]。 土壤中Cd 富集，将导致这些土壤不适合耕种， 尤其是不适合种植小麦、水稻等农作物。 受Cd 污染的耕地荒废，不利于我国粮食安全。 因此，对Cd 污染耕地的治理和修复意义重大。

植物修复，是通过利用植物对Cd 吸收积累能力强的特性来清除土壤中的Cd， 达到净化土壤的效果，是Cd 污染治理和修复的重要方法。 棉花的主要产物为纤维， 其产品不进入人类的食物链，且纤维和籽棉中Cd 的积累量很低，因此棉花成为Cd污染土壤修复的先锋作物[3-5]。 但是，棉苗对Cd 胁迫的抗性较差，难以成苗，成为其应用的主要限制因素[6-7]。 为此，缓解Cd 胁迫对棉苗发育的抑制作用成为重要研究方向。

褪黑素（melatonin,MT）又称松果体素，化学名称为N- 乙酰基-5- 甲氧基色胺（C13H16N2O2），是一种与生长素具有类似结构的植物激素[8]，在植物中普遍存在，且其调节植物抗逆性的功能已经得到广泛证实[9-11]。 MT 可有效缓解逆境带来的氧化损伤，提高植物抗逆能力，在缓解盐、高温、低温、重金属以及病虫害等逆境胁迫方面都有一定的效果[12-16]。MT 作为抗氧化剂，既能在植物体内合成，也能通过外源施加达到增强植物抵抗逆境胁迫能力的目的[14]。在农业生产中为作物补充MT，可提高其抗逆能力，促进其在逆境下的生长发育，具有极大的应用前景[12-13]。 在采用MT 处理棉苗抵抗逆境方面已有研究，例如，用MT 浸种和喷施幼苗能够促进棉花在盐胁迫和干旱胁迫下的种子萌发和幼苗发育[17]。

因此，以农大棉601 为材料，通过叶片喷施不同浓度MT 的方式探究MT 对Cd 胁迫下棉苗的形态和光合生理指标的影响，明确缓解Cd 胁迫下棉苗的光合性状、根系发育等特征，以及适宜的MT 喷施浓度， 为Cd 污染地区棉花栽培提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021 年3－6 月，在河北农业大学作物生长调控实验室开展，以转基因抗虫棉农大棉601为研究材料。 挑选色泽、 形态一致的饱满种子，用75%（体积分数）的酒精表面消毒5 min，用蒸馏水反复多次清洗至无酒精残留；将种子摆入铺有干净毛巾的白色磁盘中， 再覆盖1 层白色湿润毛巾，并放入光照培养箱内培养（25 ℃，相对湿度70%，光照时间12 h）。待种子萌发后，选择120 粒萌发一致的种子播种到培养基质为蛭石的培养钵中，浇灌营养液，待幼苗长出3 片真叶时转移至水培钵中（每钵1 株）开展水培试验。

1.2 镉胁迫与外源MT 处理

以75 μmol·L－1的CdCl2溶液进行Cd 胁迫处理。在幼苗转入水培后用完全培养液培育4 d（每2 d 更换1 次营养液），于第5 天起每晚21：30 喷施外源MT（以叶片上MT 不滴落为准）。 设计如下处理，CK1（空白对照）：0 μmol·L－1CdCl2＋0 μmol·L－1MT，CK2（镉胁迫对照）：75 μmol·L－1CdCl2＋0 μmol·L－1MT，MT10：75 μmol·L－1CdCl2＋10 μmol·L－1MT，MT25：75 μmol·L－1CdCl2＋25 μmol·L－1MT，MT50：75 μmol·L－1CdCl2＋50 μmol·L－1MT，MT100：75 μmol·L－1CdCl2＋100 μmol·L－1MT 和MT200：75 μmol·L－1CdCl2＋200 μmol·L－1MT；每个处理4 个水培钵。

1.3 株高和叶面积测定

在处理后的3 d、6 d、9 d，用直尺测量每个处理的4 株棉苗的株高和叶面积。株高是从棉花子叶节到生长点的长度。 叶面积采用长宽乘积法计算，系数采用0.73。

1.4 叶绿素测定

在处理第3 天、第6 天、第9 天用SPAD 叶绿素测量仪（Konica-Minolta 公司，日本）测定各处理的主茎倒3 叶，避开叶脉随机测定6 个点，取平均值，获得该植株叶片叶绿素含量（SPAD 值）。

1.5 光合参数的测定

参照李合生等[18]的方法使用便携式光合测定仪Li-6400（LI-COR 公司，美国）于处理第6 天、第9 天9：00－1l：00 采用红蓝光源叶室（光量子通量密度为600 μmol·m－2·s－1，CO2浓度为400 μmol·mol－1）测定以下参数：叶片净光合速率（net photosynthetic rate,Pn）、气孔导度（stomatal conductance,Gs）和蒸腾速率（transpiration rate,Tr）。

1.6 根系长度、根表面积测定

处理后第10 天用剪刀把棉株横切，用水将根系冲洗干净，擦干。参照张娜等[19]的方法扫描根系，用根系分析软件WinRHIZO 测算根系长度和表面积。

1.7 棉苗干物质质量的测定

处理后第10 天，参照Tan 等[20]的方法测定棉苗的干物质质量。 将棉株放入100 ℃烘箱中30 min，然后在80 ℃左右烘干至质量恒定， 用分析天平测定其干物质质量。

1.8 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 进行数据整理，采用Graphpad prism 9 进行图形绘制。 用SPSS 22.0 进行方差分析，采用新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 外源MT 对镉胁迫下棉苗生长形态的影响

棉苗的叶面积和株高是判断棉花发育优劣的直观表型指标（图1）。由图2 可知，在处理后的第3天、第6 天、第9 天，CK2处理的叶面积较CK1分别显著下降29.86%、38.63%、39.99%， 说明随着Cd胁迫时间延长，Cd 对棉苗的胁迫效应增强。不同浓度MT 对Cd 胁迫下幼苗株高和叶面积的促进效果表现出先升高再下降的趋势 （图1～3）。 其中：MT50处理对Cd 胁迫的缓解作用最大，棉花株高较CK2高12.8%， 叶面积较CK2高20.89%；MT200处理与CK2处理的叶面积和株高没有显著差异 （图3），没有表现出促进效应。

图1 处理后第9 天各处理棉苗生长情况

图2 各处理棉苗叶面积的比较

图3 各处理棉苗株高的比较

2.2 外源MT 对镉胁迫下棉苗干物质质量的影响

Cd 胁迫处理（CK2）的棉苗干物质质量显著降低（图4），较CK1降低了51.15%，严重影响了幼苗光合产物积累。 喷施MT 表现出对Cd 胁迫的缓解效应，并且缓解效应随着喷施浓度升高呈现先升高再降低的趋势。 其中：50 μmol·L－1MT 的缓解效果较佳， 其干物质质量较CK2显著提升了43.31%；MT10、MT25干物质质量分别较CK2显著增加了29.13%、35.43%；MT100、MT200干物质质量与CK2并无显著差异。

图4 各处理棉苗干物质质量的比较

2.3 外源MT 对镉胁迫下棉苗叶片叶绿素含量（SPAD 值）的影响

如图5 所示，处理后的第3 天、第6 天、第9 天时，CK1的叶片叶绿素含量显著高于Cd 胁迫处理（CK2），喷施MT 表现出对Cd 胁迫的缓解效应。 其中，MT50处理的棉苗叶片的叶绿素含量显著高于CK2， 而第3 天和第9 天MT200处理的棉苗叶片的叶绿素含量则与CK2相比无显著性差异。 表明Cd胁迫下，适宜浓度的MT 能够提高棉苗叶片的叶绿素含量，增强棉苗的光合能力，提升棉花的干物质质量。

图5 各处理棉苗叶片叶绿素含量（SPAD 值）的比较

2.4 外源MT 对镉胁迫下棉苗Pn 的影响

如图6 所示， 处理后第6 天时，CK1的叶片Pn为10.61 mol·m－2·s－1，Cd 胁迫处理（CK2） 的仅为3.40 mol·m－2·s－1， 显著下降了67.95%（P＜0.05）；处理后第9 天时，CK1的叶片Pn为16.93 mol·m－2·s－1，CK2的Pn为10.37 mol·m－2·s－1，较CK1显著下降38.75%（P＜0.05）。 在处理后第6 天时， 与CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200处理的Pn分别显著增加40.88%、66.47%、98.24%、57.65%和60.29%，其中50 μmol·L－1MT 处理最高。 在处理后第9 天时， 与CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200的Pn分别显著增加了30.47%、35.49%、51.59%、43.78%和31.53%， 其中50 μmol·L－1MT处理表现最佳。说明适宜浓度的MT 处理能够提升Cd 胁迫下棉苗叶片的Pn。

图6 各处理棉苗净光合速率（Pn）的比较

2.5 外源MT 对镉胁迫下棉苗Gs 的影响

如图7 所示， 处理后第6 天时，CK2棉苗的Gs较CK1显著下降51.64%； 第9 天时，CK2的Gs较CK1显著下降50.36%。 在处理后第6 天，与CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200处理棉苗的Gs分别显著增加52.61%、72.54%、101.04%、88.6%和46.11%；其中，50 μmol·L－1MT 处理最高。 在处理后第9 天时， 与CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200处理棉苗的Gs分别增加了26.87%、48.02%、62.38%、14.75%和4.15%； 其中，50 μmol·L－1MT 处理最高， 且与MT10、MT100、MT200处理均有显著性差异（P＜0.05）。可见，MT100和MT200处理棉苗的Gs没有上升反而下降， 尤其是处理后第9天时MT100和MT200处理棉苗的Gs较CK2增长比例较低，且与CK2之间无显著差异。 说明适宜浓度的MT 处理能够提高棉苗的Gs， 且具有较强的促进作用。

图7 各处理棉苗气孔导度（Gs）的比较

2.6 外源MT 对镉胁迫下棉苗Tr 的影响

如图8 所示，CK2处理棉苗的Tr在处理后第6天时较CK1显著下降85.99%， 在处理后第9 天时显著下降57.14%。 处理后第6 天时，与CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200棉 苗 的Tr分 别 增加79.17%、102.56%、160.22%、122.23%和53.84%；其中，50 μmol·L－1MT 处理最高， 并与CK2、MT10和MT200存在显著性差异。 在处理后第9 天时，与CK2相 比，MT10、MT25和MT50棉 苗 的Tr分 别 增 加4.69%、21.19%、27.45%， 而MT100和MT200棉苗的Tr分别下降4.59%和15.94%。 可见，随着MT 浓度逐渐上升，MT100和MT200棉苗的Tr没有继续上升反而下降。说明一定浓度的MT 处理能够提高棉苗的Tr，且具有较强的促进作用，而高浓度MT 处理则可能会加重Cd 胁迫对棉苗Tr的抑制作用。

图8 各处理棉苗蒸腾速率（Tr）的比较

2.7 外源MT 对镉胁迫下棉苗根系的影响

如图9 所示，在Cd 胁迫下，单株根长与单株根系表面积均明显降低。 在单株根长方面，CK2较CK1显著降低46.09%； 在单株根系表面积方面，CK2较CK1显著降低46.89%。 而喷施一定浓度的MT，表现出对Cd 胁迫的缓解效应，以喷施50 μmol·L－1MT 处理效果较佳， 单株根长较CK2显著提升33.32%，单株根系表面积较CK2显著提升43.91%；而喷施高浓度（200 μmol·L－1）MT 处理的棉苗单株根长与单株根系表面积与CK2并无显著差异。 说明不同浓度MT 处理对Cd 胁迫下棉苗地下部生长指标的促进作用表现出与地上部生长指标相似的变化趋势，即一定浓度范围内有显著效果、高浓度（200 μmol·L－1）无显著效果。

图9 各处理棉苗根系长度和表面积的比较

3 讨论

3.1 褪黑素缓解镉胁迫对棉苗生长发育的抑制作用

Cd 作为对生物毒性最强的重金属污染物之一，严重影响植物幼苗的生长发育[21-23]。 过量的Cd会影响叶绿素合成，抑制光合作用，进而减少光合产物积累，造成植株矮小[7-8]。本研究表明，75 μmol·L－1的Cd 处理显著降低了棉苗的株高、 叶面积和干物质质量，表现出显著的抑制作用，与Cd 胁迫对小麦、玉米等作物的抑制作用程度相近。 MT 作为一种有效的抗氧化剂，其喷施可以提高植株的抗氧化能力，促进相关基因表达，缓解逆境胁迫对植株的伤害。 吕怡颖等[24]发现外源MT 可缓解Cd 胁迫对烟草的毒害。 根系是响应Cd 胁迫的重要器官，其形态也受到Cd 胁迫的影响，这种形态结构的变化对减少Cd 的吸收具有重要作用。 本研究发现Cd 胁迫下喷施MT 能够缓解Cd 对棉苗的伤害，随着MT 浓度的上升其效力呈现出先升高再降低的趋势，其中50 μmol·L－1的外源MT 能够有效缓解Cd 胁迫对棉苗株高、叶面积、干物质质量和根系的抑制，甚至与无胁迫条件下的棉苗相近。 这与李亮等[25]研究得出的缓解Cd 胁迫对紫苏根系发育抑制作用的适宜MT 浓度相近。 因此，适宜浓度的MT 能够在一定程度上缓解Cd 对棉苗生长的抑制作用。

3.2 褪黑素对镉胁迫下棉苗叶片中光合作用的调控

叶片是植株光合作用的重要部位，为植株提供光合产物与能量，保证了植物的正常生长发育。 Cd胁迫会破坏植株的叶绿体结构， 抑制气孔开放，使光合作用受到严重抑制[26]。 叶绿素是植物进行光合作用的基础，其含量的变化可反映光合作用效率的高低[27]。 李玲等[28]研究表明，高浓度Cd 会抑制棉花叶绿素的合成和光合作用，进而使棉株的生长受到抑制。而外源MT 能够促进植物叶片光合相关基因的表达，保护叶片的光合系统[29]。 本研究发现，75 μmol·L－1的Cd 胁迫对棉苗叶绿素含量、Pn和Gs具有极强的抑制作用； 喷施一定浓度的MT 能缓解Cd 胁迫伤害，随MT 浓度的升高表现为一定浓度范围内有显著效果、高浓度无显著效果，其中50 μmol·L－1的MT 的缓解效应最强， 暗示MT 可能影响光合作用。同时发现，MT 对Cd 胁迫下叶片的Tr也具有相似的缓解效应， 且也是在50 μmol·L－1时缓解效应最佳。

外源激素对作物生长的调控一般存在剂量效应。 本研究发现当外源MT 浓度达到100 μmol·L－1时，其对Cd 抑制棉苗光合作用、气孔导度和蒸腾速率（图7、图8）的缓解效应开始下降。此前对外源MT 缓解盐胁迫下棉苗生长发育的研究也得到高浓度缓解效应减弱的结果， 但是缓解效应最优的MT 处理的浓度达到了200 μmol·L－1[30]。 因此，认为外源MT 缓解Cd 抑制棉苗光合作用的效果与其浓度密切相关。

3.3 在镉污染下棉花生产中施用外源褪黑素的可行性

棉花是Cd 污染农田重要的先锋作物[3-5,31-32]。但Cd 也会对棉苗的生长发育产生不利影响[6-7,31]。 本研究发现，采用50 μmol·L－1的MT 能够促进Cd 胁迫下棉苗的生长和光合作用，且效果显著。 烟草研究中发现，100 μmol·L－1的MT 处理能显著缓解Cd胁迫对幼苗发育的抑制作用[24]。 可见，对于不同植物，适宜浓度MT 对Cd 抑制植物幼苗生长发育的缓解效应均可达到显著水平。 因此， 针对一定Cd污染程度的棉田， 喷施适量MT 促进棉苗发育、壮苗具有可行性。 日后应进一步在Cd 污染区开展大田研究， 明确MT 对Cd 污染区棉花产量的影响效应。

4 结论

本研究条件下，75 μmol·L－1Cd 胁迫抑制棉苗的光合作用，缓解Cd 抑制作用的适宜MT 浓度为50 μmol·L－1。 喷施50 μmol·L－1的MT 可缓解Cd对棉苗光合作用的抑制，减轻对根系的伤害以及植株干物质积累量的下降程度； 喷施小于25 μmol·L－1的MT，缓解Cd 对棉苗光合抑制的效果明显降低；大于100 μmol·L－1的MT 处理，对棉苗Cd 胁迫的缓解效应也显著降低。 据此初步认为， 施用MT 能有效地改善Cd 胁迫条件下棉苗的生长状况，增强其光合作用能力、根系发育，从而提高棉花耐镉性，但具体浓度还有待进行多点、多品种试验进一步验证。