模拟物流对不同浆果提取物抗氧化活性变化的影响

肖淦泓，王敏，侯传丽，廖林锋，张颖，任娇艳,3*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510641）（2.无限极（中国）有限公司，广东广州 510665）（3.中新国际联合研究院，广东广州 510405）

浆果（如蓝莓、树莓、接骨木莓等）富含多酚类物质，具有经济价值高、风味独特、营养价值高等优点。研究报道浆果具有抗菌、抗炎、抗病毒、促进血管张力等生物活性[1]，而多酚类物质（如花色苷类、黄酮醇类、酚酸类等）是发挥其生物活性的主要成分之一[2,3]。由于多酚类化合物性质活泼，因此在加工、贮藏和物流运输过程中，浆果易受温度、氧气和光照等因素影响而造成其所含多酚类物质含量损失或生物活性降低等问题[4,5]。比如，多酚结构中的酚羟基易发生自氧化反应，产生过氧化物，使多酚含量降低，生物活性下降。多酚芳香环上的极性取代基的数量和位置均会影响其化学性质。环上羟基的存在使花青素在酸性溶液中带正电荷，过多的羟基会降低花青素分子的稳定性[6]；温度是影响多酚稳定性的重要因素之一，在较高温度储存时，多酚会发生水解、氧化等反应，直接导致其结构的变化[4]；光对于植物多酚的生物合成至关重要，但也会加速其降解，黑暗环境下储存对多酚具有保护作用。此外，在不同贮藏条件下，环境温度改变对不同浆果总多酚含量和抗氧化活性均有不同程度降低[7]。

浆果在物流过程中，尤其是陆运，面临着温度高、运输久、颠簸震荡等问题。在阳光照射充足的条件下，夏季路面温度比气温高10～20 ℃，最高可达55 ℃以上[8]。由于不同材质的厢体导热性不同，非冷链运输车厢内温度随着陆运时间增加而上升的趋势也不同，物料温度亦随之上升，这将直接影响浆果产品的活性成分。通常采用冷链运输、气调保藏、添加蓄冷剂等方法以解决厢体内高温问题。实际公路运输中，白天的热量不断积累，根据企业提供的监测数据显示，00:00 a.m.至7:00 a.m.车厢内温度上升速率较低，约0.7 ℃/h；7:00 a.m.至6:00 p.m.随着阳光照射强度增加，车厢内温度上升速率加快，约2.0 ℃/h；6:00 p.m.至12:00 p.m.光照减弱但车厢内热量无法传递至厢外，导致车厢内温度仍在持续上升，但速率放缓，约1.0 ℃/h。

浆果提取物作为功能性食品市场的重要原料，目前运输过程对其功能成分含量及活性的影响尚不明晰[8]，且大多数研究对象为浆果鲜果而非已加工产品。因此，本研究探究在模拟夏季公路运输条件下，蓝莓、树莓和接骨木莓的提取物总多酚含量和体外抗氧化活性变化，为未来相关功能食品开发及物流运输条件的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物均由无限极（中国）有限公司提供。没食子酸标准品、无水乙醇、磷酸氢二钾，天津市大茂化学试剂厂；碳酸钠，广州化学试剂厂；水溶性维生素E（Trolox）、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2'-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH ），Sigma-Aldrich 美国，纯度≥97%；1.1-二苯基-2-苦肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·），纯度为96%，上海麦克林生化科技有限公司；福林酚，上海源叶生物科技有限公司。以上试剂如无特殊说明均为AR 级，实验用水均为去离子水。

1.2 主要仪器设备

Binder KB240 型低温恒温箱，宾德环境试验设备（上海）有限公司；Synergy H1 型全功能微孔板检测酶标仪，美国BioTek 公司；Model 752 型紫外分光光度计，上海现科分光仪器有限公司；EXD-622B 型电子天平，福州华科电子仪器有限公司；XW-80A 型涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PHS-3C 型pH 计，雷磁上海仪电科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟物流实验

本实验模拟非冷链夏季公路运输的温度变化和时间积累，准确称取2 g 样品粉末于棕色EP 管中，并置于Binder KB240 型低温恒温箱中，经过30 ℃（7 h）→35 ℃（6 h）→45 ℃（5 h）→55 ℃（5 h）→60 ℃（1 h）→30 ℃（进入新循环）共计24 h 循环模拟物流条件，并分别在第0、24、48 和72 h 取出样品粉末，每组样品设置三个平行。待样品温度降至室温后置于4 ℃冰箱中贮存，以待后续检测使用。本实验中温度和时间参数均依据非冷链物流实际经验参数设置，以模拟在夏季夜间与白天公路运输的实际车厢温度变化（图1）。

图1 模拟物流示意图Fig.1 Schematic diagram of logistics simulation

第一阶段：模拟夜间运输，温度恒定为30 ℃，持续时间7 h；

第二阶段：模拟白天运输，温度变化和持续时间设置为35 ℃（6 h）→45 ℃（5 h）→55 ℃（5 h）；

第三阶段：模拟车厢隔热，经历白天后的热量积累且未能及时散热，温度恒定为60 ℃，持续时间1 h，此后再进入下一周期的循环。

1.3.2 多酚含量测定

参考GB/T 8313-2018 中福林酚法并稍作修改，测定样品多酚含量。

1.3.2.1 标准曲线绘制

没食子酸标准溶液配制：准确称取没食子酸粉末10 mg 并配制浓度为100 μg/mL 没食子酸标准溶液。将100 μg/mL 的没食子酸标准溶液分别吸取0、50、100、150、200、250 μL 于试管，再分别依次加入500、450、400、350、300、250 μL 去离子水于对应试管中，得到0、10、20、30、40、50 μg/mL 没食子酸标准溶液。向上述没食子酸标准溶液中分别加入2.5 mL 福林酚，涡旋摇匀，室温反应5 min 后立即加入2 mLw=7.5%Na2CO3溶液，涡旋摇匀，室温静置60 min。在765 nm处测定标准溶液吸光值，记录数据。以上实验均避光进行。

以没食子酸为标准品，得到线性回归方程y=0.011 8x+0.052（R2=0.997 0），表明没食子酸浓度在0～50 μg/mL 范围内与吸光度的线性关系良好（图2）。

图2 没食子酸标准曲线Fig.2 Gallic acid standard curve

1.3.2.2 样品多酚含量测定

待测液配制：准确称取样品粉末10 mg 并配制浓度为5 mg/mL 样品溶液。吸取50 μL 待测液于试管中，加入450 μL去离子水稀释得到浓度为0.5 mg/mL待测液。分别向上述待测液中加入2.5 mL 福林酚，涡旋摇匀，室温反应5 min 后立即加入2 mLw=7.5% Na2CO3溶液，涡旋摇匀，室温静置60 min。在765 nm 处测定待测液吸光值，记录数据。以上实验均在避光条件下进行。

样品多酚含量按式（1）计算：

式中：

Z——多酚质量分数，%；

C0——空白液浓度，μg/mL；

C1——待测液浓度，μg/mL；

V1——加入待测液于试管中的体积，本实验为50 μL；

V2——终体系的体积，本实验为5 mL；

CY——样品溶液浓度，本实验为5 mg/mL。

1.3.3 DPPH·清除率测定

参照文献[9]，用DPPH·清除率IC50值来表征提取物的抗氧化活性。Ai：取2 mL 样品和2 mL DPPH·溶液于试管；Aj：在试管中取2 mL 样品和2 mL 无水乙醇于试管；Ac：取2 mL 无水乙醇和2 mL DPPH·溶液于试管。三组均振动10 s，在37 ℃恒温箱中保温30 min 后，采用分光光度计测定样品517 nm 处吸光值。按照式（2）计算DPPH·清除率（记为F，%）：

1.3.4 氧自由基吸收能力（ORAC）测定

参照文献[10]方法，并稍作修改，采用酶标仪检测样品荧光强度的变化，实验步骤如下，分别向96 孔板中加入20 μL 待测样品、Trolox（6.25、12.5、25、50 μmol/L）标准液和磷酸缓冲工作液，37 ℃孵育10 min 后，加入200 μL Fluorescein 孵育20 min，其中对照组加入20 μL 磷酸缓冲工作液，其余每孔加入20 μL AAPH，检测2 h 内反应液在538 nm 处吸光值的变化。氧自由基清除能力ORAC 值为通过相对荧光衰减曲线面积S的变化计算并以Trolox 当量表示，公式如下：

式中：

Q——氧自由基清除能力（ORAC）；

S——荧光淬灭曲线下面积；

△t——相邻两个时间点之间的时间间隔，s；

F0,F1,...,Fn——分别表示淬灭曲线的微分。

1.3.5 数据处理

所有数据均为3 次重复的平均值和标准差（Means±SD），图表由Prism 8 分析绘制，采用SPSS 20.0 软件单因素方差分析方法对数据进行显著性检验和线性回归分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 模拟物流前后多酚含量变化

浆果果实中多酚类物质稳定性易受温度影响，温度较高时，多酚会发生水解、氧化等反应，直接导致其结构变化及含量下降[5]。为了分析蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物中多酚含量经模拟物流运输条件下的变化，采用Folin 酚法测定三者在不同物流循环时间下的多酚含量。模拟物流前（第0 d）接骨木莓提取物、蓝莓提取物和树莓提取物多酚质量分数分别为14.96%、5.11%和2.53%。然而，对比模拟物流前后蓝莓提取物和树莓提取物的多酚含量，发现二者均无显著性差异（p＞0.05）；但接骨木莓提取物经模拟物流后（第3 d）的多酚质量分数显著高于模拟物流前的多酚质量分数，达到17.03%（p＜0.05）（图3）。三种浆果提取物多酚含量的变化可能由于结合态多酚转变为游离态多酚，导致三者间的差异[11]。矫馨瑶等发现浆果果实多酚含量在30 ℃时多酚保存率出现显著下降（p＜0.05）[5]，此现象与本文结果不同，推测可能由于提取物的含水量极低，降解反应较难发生，导致浆果提取物多酚含量变化与浆果果实多酚含量变化间的差异。通过对数据库 Phenol-Explorer 3.6（http://phenol-explorer.eu/）[12]中有关接骨木莓、蓝莓和树莓多酚物质的汇总数据分析可知，三者多酚含量分别为1 358.66、307.02 和203.50 mg/100 g，其比例与本实验中采用福林酚法实际测得的接骨木莓提取物、蓝莓提取物和树莓提取物的多酚质量分数比例相近。

图3 三种浆果提取物总酚含量Fig.3 Total phenol content of three kinds of berry extract

2.2 模拟物流前后DPPH·清除活性变化

DPPH·清除率是体外评价多酚类物质抗氧化活性的常用手段之一[13]。在第0 天时三种提取物中DPPH·半数清除浓度IC50值大小顺序为树莓提取物＞蓝莓提取物＞接骨木莓提取物，而三者的多酚含量恰好相反，表明多酚含量越高，DPPH·清除活性越强。与第0 天相比，模拟物流后三种浆果多酚提取物的IC50值在第3 天显著升高（p＜0.05）且平均增长率均超过20%，蓝莓提取物IC50值平均增长率最高，达63.32%（图4a 和图4b）。为进一步分析三种浆果多酚提取物模拟物流不同天数的DPPH·清除活性变化，分别将三种浆果提取物第n天的IC50值与第n-1天的IC50值作差得到第n天ΔDPPH（图4c）。在模拟物流第1 天时三种浆果提取物ΔDPPH均较低；在模拟物流第2 天时树莓提取物和蓝莓提取物ΔDPPH均为正值（分别为973.33 μg/mL 和156.93 μg/mL），而接骨木莓提取物ΔDPPH趋近于0；在模拟物流第3 天时蓝莓提取物ΔDPPH明显升高，而接骨木莓提取物ΔDPPH仍较低。结果表明，在模拟物流条件下，三种浆果提取物DPPH·清除活性稳定性依次为树莓提取物＜蓝莓提取物＜接骨木莓提取物，三者在模拟物流第1 天后DPPH·清除活性均较稳定，第2 天后树莓提取物和蓝莓提取物DPPH·清除活性均明显降低，接骨木莓提取物DPPH·清除活性在三天模拟物流过程中较稳定。Hacer 等[14]将浆果中花青素和非花青素馏分进行抗氧化活性对比，发现花青素馏分DPPH·清除活性高于非花青素馏分，由于花色素环上羟基化和甲氧基化程度和位置影响其形成的花色苷稳定性和抗氧化性[15]，因此花青素及花色苷含量越高、种类越多，其稳定性越强且对DPPH·清除活性的贡献越大。

图4 三种浆果提取物DPPH·清除活性及变化Fig.4 DPPH· scavenging activity and change of three kinds of berry extract

根据数据库Phenol-Explorer[11]可知，接骨木莓中花色苷绝对含量最高（1 316.66 mg/100 g），故具有最高的初始DPPH·清除活性且稳定性最好；蓝莓的多酚组成较复杂，花色苷、酚酸和黄酮醇绝对含量分别为133.99、133.23 和39.8 mg/100 g，故初始DPPH·清除活性比接骨木莓低；树莓花色苷含量最低（71.94 mg/100 g），对DPPH·清除活性贡献较大的鞣花单宁Lambertianin C 和Sanguin H-6 含量较高（分别为30.84 mg/100 g 和76.10 mg/100 g）[16]，但二者在中性、高温（60～80 ℃）下易降解[17]。得出结论，模拟物流温度变化和时间积累对蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物的DPPH·清除活性均有显著影响（p＜0.05）。

2.3 模拟物流前后ORAC 活性变化

氧自由基吸收能力是体外评判抗氧化活性的重要手段，通常以水溶性维生素E（Trolox）为定量标准。树莓提取物、蓝莓提取物和接骨木莓提取物初始Trolox 当量分别为0.67、1.44 和1.36 μmol Trolox/mg，三者ORAC 活性顺序依次为蓝莓提取物＜接骨木莓提取物＜树莓提取物（图5a）。在模拟物流不同循环周期下，三种浆果提取物ORAC 活性均有较大波动。经历3 d 模拟物流后，树莓提取物、蓝莓提取物和接骨木莓提取物的Trolox 当量总损失率分别为32.74%、19.72%和62.76%（图5b）。为进一步分析三种浆果提取物在模拟物流不同天数下ORAC 活性的变化，分别将三种浆果提取物第n天的Trolox 当量值与第n-1 天的Trolox 当量值作差得到ΔORAC（图5c）。在模拟物流第 1 天时，仅蓝莓提取物ΔORAC为负值（-0.74 μmol Trolox/mg），而树莓提取物和接骨木莓提取物ΔORAC≥0，说明在模拟物流第1 天后，蓝莓提取物ORAC 活性出现明显下降，而树莓提取物和接骨木莓提取物ORAC 活性较稳定；在模拟物流第2 天时，接骨木莓提取物ΔORAC为负值（-1.30 μmol Trolox/mg），ORAC 活性下降；在模拟物流第3 天时，树莓提取物ΔORAC为负值（-1.00 μmol Trolox/mg），ORAC 活性下降。结果表明，在模拟物流条件下，三种浆果提取物ORAC 活性波动较大，活性下降后仍可能上升，根据首次出现活性下降时间先后顺序来评判三者稳定性大小，依次为蓝莓提取物＜接骨木莓提取物＜树莓提取物。接骨木莓提取物的多酚质量分数在模拟物流后显著升高（p＜0.05），表明接骨木莓提取物中多酚组分含量及比例发生变化，由于酚类物质的组分含量及比例不同会影响整体的氧自由基吸收活性[17]。因此推断每经历24 h 模拟公路运输温度变化条件后，蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物中多酚组分发生不同程度的变化，并在不同循环时间下表现出不同的ORAC活性。得出结论，模拟物流可能会通过改变酚类物质组分含量及比例引起蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物ORAC 活性变化，三者ORAC 稳定性依次为蓝莓提取物＜接骨木莓提取物＜树莓提取物。

图5 三种浆果提取物ORAC 活性及变化Fig.5 ORAC activity and change of three kinds of berry extract

3 讨论

浆果含有丰富的多酚类物质，具有较强的抗氧化能力，其提取物常被用作功能性食品的原料。然而，多酚类物质由于存在活性酚羟基而易在运输过程中损失，使其生物活性降低[4,5,18,19]。与其它文献对浆果果实的研究结果不同[20]，本文发现三种浆果提取物的多酚含量经过模拟物流三天后并未明显降低，但DPPH·清除活性和ORAC 活性均有显著变化。如图6a所示，三种浆果的多酚组成不同，但均含有花色苷类和黄酮醇类物质，不同的组分对ORAC 和DPPH·清除活性的贡献不同。将Lutz 等[21]对不同蔬果多酚含量及抗氧化活性检测数据进行相关性分析，结果显示总多酚含量与DPPH·清除活性相关系数最高（R=0.94），总花色苷含量与ORAC活性相关系数最高（R=0.97）（图6b）。此结果提示在模拟物流过程中三种浆果提取物可能受到温度升高和时间积累的影响，其花色苷降解成花色素。花色素单体在连接不同糖基后抗氧化活性将发生不同的变化[15]，因此ORAC 活性可能在不同循环时间下发生波动。此外，三种浆果提取物总酚含量均出现先下降后上升的趋势，相应DPPH·半数清除浓度IC50先上升再下降，但总体而言DPPH·清除活性均下降。

图6 （a）接骨木莓、蓝莓和树莓多酚组成；（b）蓝莓、树莓和接骨木莓多酚组成与DPPH·清除活性和ORAC 的相关性分析[21]Fig.6 (a) Polyphenol composition of blueberry extract,raspberry extract and elderberry extract;(b) Analysis of correlation between polyphenol composition and DPPH· scavenging activity and ORAC in blueberry,raspberry and elderberry

4 结论

本实验通过模拟夏季陆地运输温度变化和时间积累过程以探究蓝莓提取物、树莓提取物和接骨木莓提取物的多酚含量及其抗氧化活性变化。结果显示，在模拟物流温度变化和时间积累的条件下，接骨木莓提取物多酚含量显著增加，而蓝莓提取物和树莓提取物多酚含量受模拟物流影响较小；三者DPPH·清除活性均显著降低，在模拟物流第1 天时三者DPPH·清除能力较稳定，而在第2 天后蓝莓提取物和树莓提取物的DPPH·清除能力出现不同程度失稳，仅接骨木莓提取物在三天模拟物流后仍能保持较高的DPPH·清除能力，三者DPPH·清除活性稳定性依次为树莓提取物＜蓝莓提取物＜接骨木莓提取物；三者ORAC 活性波动较大，按照首次出现活性下降时间先后顺序来评判三者稳定性大小，依次为蓝莓提取物＜接骨木莓提取物＜树莓提取物。因此，在运输过程中，运输条件（温度和时间）可对浆果提取物中多酚类物质的含量及抗氧化活性产生影响，且提取物的抗氧化能力与酚类物质的种类及占比存在一定的相关性。