鼻鼽合剂对过敏性鼻炎模型小鼠体内Th17/Treg失衡的影响

2022-11-08 03:23邓可斌易新林余昪昪雷西熙
山西医科大学学报 2022年9期
关键词:合剂空白对照低剂量

马 欣,邓可斌,陈 颖,易新林,李 辉,余昪昪,雷西熙

(湖北省中医院耳鼻喉科,武汉 430074;*通讯作者,E-mail:qcsdxsd@163.com)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是特异性个体接触过敏原后,由免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介导的发生在鼻黏膜的I型变态反应性疾病,多种炎症介质、细胞因子参与AR的发病过程,临床上以鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕为主要症状[1]。AR的发病机制复杂,其发生主要与Th1细胞和Th2细胞相关[2]。其中,Th1细胞参与抗微生物炎症反应,而Th2细胞参与气道炎症形成和发病,能分泌白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子[3]。Th1/Th2的失衡会造成AR的发展,而γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和IL-4作为Th1和Th2细胞因子代表,它们的相互作用是维持Th1和Th2平衡的关键[4]。除了Th1细胞和Th2细胞外,也有研究发现,Th17细胞特异产生的白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)也与气道炎症和高反应性密切相关,可诱导中性粒细胞在局部的募集和活化,上调Th2细胞调控的嗜酸粒细胞炎症[5]。另外,叉头样转录因子3(forkhead box p3,Foxp3)+Treg是目前已知的抑制功能最强、抑制谱最广泛的一类免疫细胞,在维持自身免疫耐受中发挥重要作用,AR中的过敏反应也有可能与之相关[2]。在祖国传统医学中,AR属于“鼻鼽”范畴,中医认为,肺、脾、肾三脏亏虚,导致人体正气不足、腠理疏松、卫外不固,风寒之邪容易侵袭,使得寒气郁闭,阳气不达,从而导致AR的发生[6,7]。鼻鼽合剂为治疗AR的有效经验方剂,在临床上有很好的疗效。研究证实,鼻鼽合剂具有促进Th1/Th2分泌的多种细胞因子之间的平衡等功能[8,9],然而,鼻鼽合剂是否对Th17/Treg有影响却仍没有充分的研究。而辛芩作为传统中医药已被证实对治疗AR有很好的疗效[10],用于与许多药物联合对AR进行治疗[11-13],辛芩也可以对Th1/Th2细胞因子产生一定的影响[14]。因此,本研究通过构建小鼠AR模型,检测鼻鼽合剂干预后Th17/Treg在小鼠体内的变化,并把辛芩颗粒作为阳性对照组,研究鼻鼽合剂对AR小鼠体内Th17/Treg失衡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康状况良好的6周龄BALB/c雌鼠25只,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2018-0104;于温度22~26 ℃,相对湿度50%~60%的饲养条件下进行饲养,人工光照明暗各12 h。在本次实验过程中,按照《实验动物管理条例》等相关文件标准进行饲养与处置。

1.1.2 试剂 戊巴比妥钠(货号P3761,德国sigma公司);鸡蛋清蛋白(货号A107821,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);氢氧化铝(货号239186,德国sigma公司);辛芩颗粒(货号190122,四川同人泰药业有限公司);伊红,中性树脂,苏木素(货号分别为E8090,G8590,G1140,北京索莱宝科技有限公司);SYBR FAST qPCR Master Mix(货号KM4101,美国KAPA Biosystems公司)。

1.1.3 仪器 正置显微镜,石蜡切片机(型号分别为DM1000,RM2235,德国徕卡公司);摊片烤片机(型号为TKD-TK,湖北康强科技发展有限公司);生物组织包埋机-冷冻机,生物组织包埋机(型号分别为TB-718L,TB-718D,湖北泰维科技实业股份有限公司);自动组织脱水机(型号为TKD-TSF,湖北康强科技发展有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠AR模型的构建与鉴定 取160 μg卵清蛋白,80 mg氢氧化铝,分别加入8 000 μl PBS中配制腹腔注射药物。将小鼠分为空白对照组(5只)和AR模型组(20只)。模型组致敏阶段于第1天开始,在第1,3,5,7,9,11,13天向每只小鼠腹腔注射药物200 μl。模型组激发阶段于第21天开始,用5%卵清蛋白溶液(货号A107821-5g,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)对小鼠分别进行雾化吸入30 min(雾化率约为30 mg/m3),30 min之后,用配制好的体积分数10%的卵清蛋白溶液滴入小鼠两侧鼻腔,用1 ml注射器去针头后每侧鼻腔各滴入10 μl,每天激发1次,连续7 d。

依据症状(喷嚏、流涕、鼻痒)评估总分判定AR小鼠造模是否成功。末次雾化、滴鼻激发后观察30~60 min,采用叠加量化加分,总分大于5分表示建模成功,小鼠行为学症状分级评分标准见表1。

1.2.2 分组干预 除空白对照组(5只)外,将20只建模成功的小鼠随机分为模型组、鼻鼽合剂低剂量组、鼻鼽合剂高剂量组与辛芩组,每组5只。空白对照组与模型组每天灌胃生理盐水一次,连续2周;鼻鼽合剂低剂量组每天按照10 g/kg剂量灌胃鼻鼽合剂1次,连续2周;鼻鼽合剂高剂量组每天按照20 g/kg剂量灌胃鼻鼽合剂1次,连续2周;辛芩组每天按照5 g/kg剂量灌胃辛芩颗粒1次,连续2周[8]。

表1 小鼠行为学症状分级评分标准

1.2.3 小鼠一般行为学观察 观察小鼠在实验过程中的精神状态、饮食饮水、活动情况以及毛发光泽度等情况。

1.2.4 苏木精—伊红染色法观察小鼠鼻中隔黏膜组织变化 将固定好的小鼠鼻中隔黏膜组织切取0.3 cm的厚度,按常规步骤脱水浸蜡包埋,切片厚度为3 μm,水浴展片,捞片,将切片小心贴附于载玻片上,控片,然后将切片放入展片器展片,贴平粘紧后烤片。根据苏木精—伊红染色法的步骤对组织切片进行染色,通过显微镜拍照,Leica Application Suite图像系统采集样本相关部位。

1.2.5 qRT-PCR检测小鼠鼻黏膜组织中IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3基因mRNA的表达 取各组小鼠鼻黏膜组织样本100 mg于含有1 ml Trizol的匀浆管中,于匀浆机匀浆20 s,立即放于冰上,抽提总RNA进行反转录,再按照SYBR GREEN PCR Kit说明书进行qRT-PCR法检测小鼠黏膜组织中IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3的mRNA表达变化情况。42 ℃运行程序60 min后,70 ℃运行程序15 min执行反转录,运行40个循环执行real-time PCR扩增。引物序列见表2。以GAPDH作为内参,用GAPDH的Ct归一目标基因的Ct得ΔCt,其次用校准样本的Ct值归一样品的ΔCt,最后计算表达水平比率:2-ΔΔCt=表达量的比值。

表2 引物序列信息

2 结果

2.1 小鼠一般行为学观察结果

造模前各组小鼠精神活跃,正常采食饮水,毛发顺滑有光泽;与空白对照组相比,模型组小鼠精神萎靡,采食与饮水次数减少,出现竖毛的情况,通过小鼠行为学症状分级评分评价,分数都高于5分,显示造模成功;经鼻鼽合剂与辛芩颗粒治疗后,小鼠精神、饮食及毛发情况均有所改善。

2.2 小鼠鼻中隔黏膜组织HE染色结果

各组小鼠鼻中隔黏膜组织HE染色结果显示,空白对照组鼻黏膜组织结构完整,上皮细胞排列整齐,无明显增厚及炎性细胞浸润;与空白对照组相比,模型组鼻黏膜组织可见大量炎性细胞浸润,上皮细胞排列不齐;鼻鼽合剂低剂量组鼻黏膜的炎性细胞有轻微减少,但不明显;鼻鼽合剂高剂量组和辛芩组的鼻黏膜炎性细胞有明显减少,少量炎性细胞浸润,但辛芩组和鼻鼽合剂高剂量组相比,仍然较多的炎性细胞浸润(见图1)。

图1 小鼠鼻中隔黏膜组织HE染色结果Figure 1 HE staining of mouse nasal septum mucosa

2.3 各组小鼠鼻黏膜组织IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3 mRNA的表达情况

与对照组相比,模型组鼻黏膜组织中的IL-4、IL-17、IFN-γ与Foxp3的mRNA表达水平显著升高(P<0.05);经鼻鼽合剂与辛芩颗粒治疗后,IL-4与IL-17的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但IFN-γ与Foxp3的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。鼻鼽合剂的低剂量和高剂量组的IL-4和IL-17的mRNA表达水平都显著低于辛芩组(P<0.05),而IFN-γ与Foxp3的mRNA表达水平都显著高于辛芩组(P<0.05)。另外,鼻鼽合剂高剂量组的IL-4和IL-17的mRNA表达量显著低于低剂量组(P<0.05),而IFN-γ与Foxp3的mRNA表达水平都显著高于低剂量组(P<0.05,见图2)。

与空白对照组比较,aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05;与辛芩组比较,cP<0.05;与低剂量组比较,dP<0.05图2 各组IL-4、IL-17、IFN-γ和Foxp3 mRNA表达比较Figure 2 Comparison of IL-4, IL-17, IFN-γ and Foxp3 mRNA expression

3 讨论

AR作为一种鼻黏膜炎症性疾病,是全球最常见的鼻部疾病之一,通常会持续终生。目前,由于环境等多种原因,AR发病率逐年升高,病程长、易反复,严重者甚至引起哮喘、过敏性咽喉炎等,严重降低患者生活质量[15]。AR发生常常会造成Th1与Th2的免疫失衡,过敏者在接触外来抗原如花粉刺激物时,抗原呈递细胞如树突状细胞等会将抗原呈递给CD4+T细胞,促进其分化为Th2细胞,并分泌IL-4。IL-4进一步促使B细胞分化,产生IgE致使过敏介质释放,刺激黏膜组织细胞造成黏膜水肿[16]。本研究HE染色结果中就表明鼻黏膜在发生AR后的炎症情况,模型组小鼠组织中有大量炎性细胞浸润且上皮细胞排列不齐。同时,模型组小鼠黏膜中IL-4的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。国内有团队[17,18]在研究Let-7e-5p、黄芪甲苷治疗AR的作用时发现,AR小鼠的鼻黏膜组织中有明显的炎性细胞浸润。而目前,调节Th1与Th2的免疫平衡是抑制AR发生的重要环节[16]。Th1细胞在白细胞介素-2(IL-2)作用下分泌IFN-γ,IFN-γ可以抑制Th2细胞分泌IL-4和抑制IgE合成,是IgE强抑制因子[19]。鼻鼽合剂在治疗AR方面的疗效也有许多报道[20]。它是通过诱导Th细胞向Th1细胞分化,抑制Th2细胞的表达促使IFN-γ的产生,抑制IL-4的形成,从而减轻嗜酸性粒细胞的活化和湿润,减少IgE的合成,从多方面阻止AR的炎症反应[9]。本研究HE染色结果显示,经鼻鼽合剂与辛芩颗粒治疗后炎症情况明显减缓。其中,鼻鼽合剂高剂量组的IFN-γ mRNA表达量显著高于其他组,也表明其促进IFN-γ的表达。

AR发生过程中还涉及Th17/Treg免疫平衡[21]。CD4+T细胞可以分化为Th17和Treg细胞,Th17细胞主要分泌前炎性因子IL-17[22],而Treg细胞的免疫抑制功能则主要由其特异性转录因子Foxp3来调节[23]。因此,IL-17和Foxp3的mRNA表达量也作为这次我们探究鼻鼽合剂发挥治疗效果的指标。本研究中的qRT-PCR检测结果显示,鼻鼽合剂治疗能够显著降低AR小鼠中IL-7表达量,高剂量的鼻鼽合剂显著增加Foxp3的表达,表明在Th17/Treg免疫平衡中,Treg免疫反应在其中发挥了主要优势。有研究指出,Foxp3+Treg的免疫调节功能与其细胞表面表达的程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)及CD4+胞内细胞周期蛋白激酶抑制因子p27kip1有关[4],这和我们的实验结果相一致。Van等[24]也证实调节Th17/Treg平衡可以使α-硫辛酸成为治疗AR的潜在药物。

祖国传统医学对于目前许多疾病都有特别的治疗效果[25,26],而祖国传统医学自身也有改进和拓展的需求。本研究把辛芩颗粒作为阳性对照组,则发现其对IL-4和IL-17的mRNA表达有一定的抑制效果,但较鼻鼽合剂要差;而且辛芩颗粒对IFN-γ和Foxp3的mRNA表达较鼻鼽合剂没有显著的促进效果。因此,鼻鼽合剂可能相对于辛芩颗粒有更好的临床效果,后续可开展针对AR的临床治疗效果的研究。

综上所述,鼻鼽合剂对小鼠的AR症状具有一定的改善效果,并且能促使Th17/Treg免疫平衡向Treg免疫反应占优趋势转化,从而调节AR小鼠体内Th17/Treg的免疫失衡,达到缓解AR症状的目的。

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