黔中不同地区马尾松林土壤真菌群落分布特征1)

张健 徐明 陈进 杨云礼

(贵州大学，贵阳，550025)

真菌作为生态系统的重要生物组分，具有十分丰富的生物多样性与独特多样的营养方式(如共生、寄生或腐生)，驱动森林土壤的碳循环，调节动植物的矿物质营养，缓解其它土壤生物的碳限制，影响森林群落的组成结构[1]。在森林生态系统中，土壤真菌与植被间的相互关联密切，在森林生态系统的营养、生产力、多样性和健康等方面发挥着关键作用[2]。考虑到土壤真菌作为监测森林土壤质量变化和生态系统稳定的重要指标，其多样性研究在评价生态系统、维护生态平衡中也发挥了巨大作用；因此，有必要加强我们对森林生态系统真菌群落多样性时空分布格局及维持机制等方面的深入研究[3]。

马尾松(PinusmassonianaLamb.)是我国南方地区林业的重要针叶树种，全国马尾松林总面积约1 420万hm2，占全国森林面积的13.2%[4]，在区域的林业经济(木材、纸浆、松脂、林下野生菌等)和生态建设(造林、植被恢复等)中占有重要地位。目前有关马尾松林的群落环境特征，以及经营措施(或干扰)对土壤微生物方面报道较多[4-6]；但目前对区域尺度上，地理空间距离对马尾松林土壤微生物多样性和功能影响的研究报道较少。因此，本文开展不同地区马尾松林土壤真菌群落多样性分布特征研究，以期为区域马尾松林土壤健康情况评价、真菌多样性资源保育及森林可持续经营管理等方面提供科学参考。

1 研究区概况

黔中地区位于贵州中部(25°25′～28°20′ N，105°47′～108°41′ E)，处于云贵高原向东部低山丘陵过渡的高原斜坡，山岭低缓，为典型的山原地貌；土地面积5.56万km2，约占全省土地总面积的31.6%；该区域是贵州喀斯特发育最典型的地区之一，喀斯特地貌占总面积的80.5%[7]。该区属亚热带季风气候，年降水量在1 100 mm以上，年均温16 ℃。土壤以黔中山原黄壤为主，土壤呈酸性。地带性植被为亚热带常绿阔叶林，现存植被类型中针叶林广泛分布(马尾松林、杉木林为主)，阔叶树种以壳斗科、樟科、木兰科、山茶科植物等为主；马尾松是该区域优势的针叶林树种之一。

2 材料与方法

本研究调查地点按从北向南空间位置依次排序，分别位于贵阳市的白云区长坡岭国家森林公园(Cpl_Mp)、花溪区久安乡(Jat_Mp)、花溪区贵州大学西校区(Guc_Mp)和安顺市的长顺县广顺农场(Gs_Mp)内生长良好的马尾松成熟林为调查样地(表1)，每块样地内设置1个20 m×20 m植被调查样方，每个地区尽量选取3块马尾松林调查样地重复(久安乡为2个调查样地重复)。每个调查样方内，调查记录样地的立地信息、植物群落信息，如乔木胸径、冠幅和树高等指标进行测量。用土钻按随机六点取样法，采集土壤0～20 cm混合土壤样品，去除土样中石块、植物根系等后，过2 mm土筛充分混匀后分为2份，分别用于DNA提取(-50 ℃冷冻干燥后，-80 ℃保存)和理化指标分析(避光风干后，室温保存)。

表1 样地基本信息

2.1 土壤理化指标

土壤的pH值采用电极法测定(V(水)∶V(土)=2.5∶1.0)；土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾低温氧化-分光光度法测定；全氮(TN)采用半微量凯氏定氮法测定；全磷(TP)采用钼锑抗比色法测定；有效磷(AP)采用双酸(H2SO4-HCl)浸提-钼锑抗比色法测定。

2.2 土壤真菌ITS扩增子高通量测序

土壤总DNA采用试剂盒(FastDNA®SPIN Kit for Soil)按说明书操作程序进行总DNA的纯化提取。利用Illumina MiSeq PE300(2×300 bp)测序平台，对通用引物ITS3F(5’- GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4R(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’)的核糖体RNA ITS2高变区进行测序。

2.3 生物信息统计

经高通量测序得到的双端序列原始数据，根据双端测序(PE)片段之间的重叠部分关系，将成对的片段拼接成一条序列，利用FLASH软件对片段质量和拼接效果进行质控过滤，再根据序列首尾两端的条形码和引物序列区分样品得到有效序列。通过Uparse软件在相似水平为97%的OTU进行聚类分析；通过Qiime软件获取OTU丰度、韦恩图、稀释曲线和α多样性，对真菌群落组成绘制聚类树-热图(丰度前50个属)，基于加权标准化unifrac距离算法，进行非度量多维尺度(NMDS)和相似性检验(ANOSIM)分析不同地区马尾松林土壤真菌群落样本间的相似性。采用典范关联分析(CCA)揭示土壤真菌群落与环境因子间作用关系。利用FUNGuild(http://www.funguild.org/)微生态工具按照营养方式对土壤真菌功能进行预测分析。利用软件Cytoscape3.7.2进行共存网络分析；选取马尾松林土壤真菌群落属水平上相对丰度排在前50位的属，对Cpl_Mp、Jat_Mp、Guc_Mp和Gs_Mp的4个地区马尾松林的土壤真菌群落样品进行共存网络分析，其中网络中的节点代表不同地区马尾松林土壤真菌群落样品或属水平的分类单元，样品节点与分类单元节点的连线代表样品与分类单元之间的关系。

3 结果与分析

3.1 马尾松林的土壤理化性质

不同地区马尾松林地的土壤理化性质统计见表2。结果表明，不同地区间马尾松林土壤pH、全氮和有效磷均存在显著性差异(P<0.05)，而土壤有机质和全磷均无显著差异(表 2)。

表2 不同地区马尾松林土壤理化性质特征

3.2 土壤真菌群落物种多样性特征

试验选取黔中地区4个调查地点马尾松林土壤样品进行高通量测序，共得到优化有效序列总数为801 442，每个样品按67 030抽平后，物种稀释曲线呈现出随着测得序列数量的增加逐渐趋于平坦(图1A)，这表明测试有效序列数据信息量能够反映土壤样本真菌群落多样性。按>97%相似度进行OTU注释，马尾松林土壤真菌群落共鉴定得到14门、55纲、143目、334科、692属、1 143种和3 337 OTUs(表3)。其中，各调查区马尾松林土壤真菌群落OTUs丰富度由大到小表现为(表3)：Guc_Mp(1636)、Cpl_Mp(1578)、Jat_Mp(1355)、Gs_Mp(1108)，且共有OTUs和特有OTUs分别占比为41.54%和58.46%(图1B)。不同地区间马尾松林土壤真菌群落α多样性的ACE指数和Chao指数(表2)均表现出显著性差异(P<0.05)。

表3 不同地区马尾松林土壤真菌的分类注释和α多样性指数

3.3 土壤真菌群落的组成结构

黔中不同地区间马尾松林土壤真菌群落组成存在明显差异(P<0.05)。在门水平上，子囊菌门(Ascomycota)(42.9%～61.9%)和担子菌门(Basidiomycota)(26.9%～46.9%)为土壤真菌群落的优势菌门(表4)，它们在所有样本中所占的平均比例分别为52.1%和36.4%；其他相对丰度占1%以上的门包括毛霉门(Mucoromycota)(0.4%～12.7%)、被孢霉门(Mortierellomycota)(0.6%～7.3%)和罗兹菌门(Rozellomycota)(0.2%～2.1%)。在纲水平上，伞菌纲(Agaricomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)和粪壳菌纲(Sordariomycetes)为土壤真菌群落的优势菌纲(表5)。

表4 不同地区马尾松林土壤真菌群落门水平的相对丰度

它们在所有样本中所占的平均比例约为78.6%。其他相对丰度占1%以上的纲包括伞形霉纲(Umbelopsidomycetes)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、未鉴定子囊菌门(unclassified_p__Ascomycota)和双担菌纲(Geminibasidiomycetes)等。马尾松林土壤真菌群落共检测记录了692个真菌属(表2)；其中，沙蜥属(Saitozyma)(2.3%～24.1%)、青霉属(Penicillium)(1.8%～13.9%)、红菇属(Russula)(0.6%～19.1%)和树粉孢属(Oidiodendron)(1.5%～18.6%)和伞状霉属(Umbelopsis)(2.3%～24.1%)为优势属，它们在所有样本中所占的平均比例可达42.4%；其他相对丰度占1%以上的属包括未鉴定刺盾炱目(unclassified_o__Chaetothyriales)、被孢霉属(Mortierella)、木霉属(Trichoderma)、产油菌属(Solicoccozyma)、未鉴定子囊菌门(unclassified_p__Ascomycota)和双担菌属(Geminibasidium)等(图2A)。

表5 不同地区马尾松林土壤真菌群落纲水平的相对丰度

3.4 土壤真菌群落相似性分析

NMDS分析发现(图2B)，不同地区马尾松林土壤真菌群落样本间明显分开，表明分析结果具有很好的代表性(S=0.068，小于0.1)。ANOSIM分析结果表明(图2C)，不同地区马尾松林土壤真菌群落间的相关性存在显著性差异(P=0.002)。通过对4个调查地点马尾松林土壤真菌群落进行相似性聚类分析，并构建热图展示相对丰度前50的真菌属(图2A)，结果表明，白云区长坡岭国家森林公园(Cpl_Mp)与花溪区贵州大学西校区(Guc_Mp)聚在一起，花溪区久安乡(Jat_Mp)与安顺市长顺县广顺农场(Gs_Mp)则聚在一起，这表明黔中山地丘陵地貌生境下，空间间隔直线距离大于10 km(或更短)时，不同地区间马尾松林真菌群落相似性可能受到空间自相关性的影响较小(该区域马尾松林真菌群落间空间自相关的距离阈值可能小于10 km)。

3.5 土壤真菌群落的功能多样性特征

真菌的生态功能类群是基于共生、腐生和病理3种营养型来划分。通过FUNGuild数据库对土壤真菌功能分类进行统计，结果表明，不同地区马尾松林土壤真菌群落的功能类群组成结构存在明显差异(表6)。未定义腐生真菌(14.4%～40.3%)、真菌寄生-未定义腐生真菌(2.4%～24.2%)、外生菌根真菌(2.4%～34.5%)为土壤真菌群落的优势功能类群，它们在所有样本中所占的平均比例约为53.8%；另外未知功能真菌(8.1%～28.0%)约为19.2%。

表6 不同地区马尾松林土壤真菌群落功能组成

3.6 土壤真菌群落的共生网络分析

在属水平上，对Cpl_Mp、Jat_Mp、Guc_Mp和Gs_Mp 4个地区的马尾松林土壤真菌群进行共存网络分析的结果(图3)显示，不同属在不同地区土壤真菌群间的关联作用存在明显差异；处于网络中心点的分类单元分别为沙蜥属(Saitozyma)、红菇属(Russula)、树粉孢属(Oidiodendron)、青霉属(Penicillium)、被孢霉属(Mortierella)、未鉴定刺盾炱目(unclassified_o__Chaetothyriales)、木霉属(Trichoderma)、未鉴定柔膜菌目(unclassified_o__Helotiales)、未鉴定子囊菌门(unclassified_p__Ascomycota)是不同地区间马尾松林真菌群落中的关联度最高的节点，这表明它们可能对马尾松林真菌群落维持与稳定具有更为重要的作用。

3.7 土壤真菌群落的影响因素分析

采用CCA分析对土壤真菌群落物种分布和环境因子的关系进行空间距离排序(图4)，结果表明，CCA1轴和CCA2轴的解释量分别为15.86%和12.23%。土壤有效磷、全氮和马尾松胸径是马尾松林土壤真菌群落物种分布的重要影响因子。

4 讨论与结论

本文探讨了黔中不同地区间马尾松林土壤真菌群落多样性与功能的分布特征。结果表明：子囊菌门和担子菌门为马尾松林土壤真菌群落的优势菌门，占样品平均相对丰度的88.5%，且子囊菌门的相对丰度高于担子菌门，马尾松林土壤真菌群落的优势门类群与以往一些报道相似，如Deng et al.[4]报道了油松林土壤真菌群落中子囊菌门和担子菌门的相对组成比例都超过95%；陈秀波等[8]报道了红松林土壤真菌群落中子囊菌门和担子菌门的相对组成比例超过70%；Zhao et al.[9]报道了樟子松林土壤真菌群落中子囊菌门和担子菌门的相对组成比例都超过85%。可见，森林土壤真菌群落中子囊菌门与担子菌门作为优势地位是相对稳定的。另外，本研究中，毛霉门(5.6%)和被孢霉门(4.1%)在马尾松林土壤真菌群落中约占10%的相对组成比例，这与它们在全球土壤真菌群落中比例(毛霉门4.4%和被孢霉门6.3%)报道较为相似[1]，二者在不同地区马尾松林土壤真菌群落中组成结构存在差异，但所占比例表现出此消彼长的趋势；因此，针对二者间在土壤真菌群落中是否存在潜在的演变规律及关键的生态调控机制是有待进一步探索。

随着高通量测序技术的突破和生物信息学的发展，土壤真菌群落空间分布格局已成为研究热点[1]。我国森林生态系统土壤微生物群落空间分布的研究主要集中在东部季风区，而有关西南和西北等地森林土壤微生物群落空间分布的研究却相对匮乏[10]。本研究选取了黔中不同地点马尾松林(同一植被类型)土壤真菌群落开展调查研究，结果表明，不同地区马尾松林土壤真菌群落间存在明显差异；从不同地区间马尾松林土壤真菌群落相似性来看，空间距离相近并不能决定马尾松土壤真菌群落相似水平；这表明黔中山地丘陵生境下，当空间间隔直线距离大于10 km(或更短)时，马尾松林真菌群落间相似性受到空间自相关性的影响较小，这可能受到山地地形的隔离作用或真菌扩散限制等因素影响，如外生菌根真菌群落相似性与空间距离的负相关性在不同区域或植被类型上表现出明显差异[11]。由此可见，黔中地区马尾松林土壤真菌群落空间分布格局可能主要受到植物群落和环境因素(土壤、气候、干扰等)的影响，本文中的CCA分析结果可进一步验证了该推测。

真菌可作为动植物的共生者、分解者或病原体发挥着重要的生态功能，它们驱动森林土壤的碳循环，调节植物的矿物质营养，缓解其他土壤生物的碳限制[1]。本研究通过FUNGuild功能分类结果表明，不同地区马尾松林土壤真菌群落的功能类群组成结构存在明显差异；其中，未定义腐生真菌、真菌寄生-未定义腐生真菌和外生菌根真菌为优势功能类群。已有报道指出马尾松林木材腐朽真菌和外生菌根真菌多样性资源丰富[12]，而且黔中地区马尾松林下一些菌根型珍稀食用菌资源有较好的开发利用前景[13]。另外，黔中地区马尾松林生境兰科植物也较丰富，相比丛枝菌根真菌及外生菌根真菌与植物的互作机制已有了比较系统的认识，我们对兰科菌根真菌生态功能的了解仍有诸多未知亟待人们深入探索[14]；因此，有关马尾松林兰科菌根真菌类群与植物间的生态作用机制有待进一步研究。

综上所述，本研究揭示了亚热带山地不同地区马尾松林土壤真菌群落的结构与功能间存在明显差异，黔中地区马尾松林土壤真菌群落空间分布格局受到植物群落和环境因素(土壤、气候、干扰等)的重要影响。