黄连木多倍体诱导及鉴定1)

李娟娟 邓伟 许泽楠 张子君 路丙社

(河北农业大学，保定，071000)

黄连木(Pistaciachinensis)是漆树科黄连木属的落叶乔木，其树形高大优美，枝繁叶茂，树冠开阔，种子含油率高，是极具开发应用的乡土园林绿化树种和木本油料树种[1-2]。目前，有关黄连木的研究主要集中在资源分布[3-4]、生理特性[5-6]、病虫害防治等方面[7]，而有关黄连木多倍体诱导和新品种培育的研究报道较少。

多倍体诱导是培育新品种的主要方法，已在花卉、农作物以及果树等方面广泛应用[8-10]。多倍体诱导的药剂通常有秋水仙素[11]、胺磺灵[12]等，诱导材料有萌动的种子、茎尖、愈伤组织等[13]。Yunus A et al.用质量分数0.05%的秋水仙素浸泡黄花蒿(Artemisiaannua)种子2 h后出现了多倍体植株[14]；孔维一等[8]用秋水仙素处理一串红(Salviasplendens)的茎尖成功获得了四倍体植株；周慧文等[15]以木薯(ManihotesculentaGrantz)组培苗单芽茎段为材料，通过离体诱导成功得到了10个同源四倍体木薯株系的四倍体植株。大量研究表明，秋水仙素是较好的多倍体诱变剂，不同的植物材料及处理部位对秋水仙素的敏感程度不同，萌动的种子诱变效果较好。程志号等[16]用5 g/L秋水仙素浸渍火龙果(Pitayapitahaya)萌动种子24 h多倍体的诱导率最高；潘宏兵等[17]用0.3%的秋水仙素处理石榴(Punicagranatum)萌发种子24 h四倍体的诱导率最高。本文以黄连木萌动种子为材料，利用不同质量分数的秋水仙素进行不同时间的诱变处理，以期获得人工诱变四倍体植株，构建黄连木多倍体诱导技术体系，为黄连木新品种选育提供种质基础。

1 材料与方法

种子于2020年9月采自河北省唐县同一母株(2n=30)。2020年12月中旬对种子进行沙藏处理，2021年3月将种子取出，待萌动种子达到70%时进行处理。

1.1 试验设计与处理

参照张虹等[18]的方法,在通风橱摇床上分别用质量分数0.1%、0.2%、0.3%的秋水仙素溶液浸泡萌动黄连木种子，浸泡时间为12、24、36、48 h，每处理50粒种子，3次重复，以无菌水浸泡为对照(CK)。处理结束后自来水冲洗4～5次，播于穴盘内。之后再将幼苗移植于20 cm×22 cm的无纺布袋中继续培养。

1.2 指标测定方法

出苗率、成苗率和半致死质量分数的计算。参照熊运海等[19]的方法，于种子播于穴盘20 d后统计出苗率、相对出苗率，50 d后统计计算成苗率。参照李映乐等[20]的方法计算半致死质量分数，在Excel表中导入秋水仙素质量分数和相对出苗率，创建质量分数-相对出苗率的线性回归方程。

诱导率的计算。幼苗生长2个月后，以未处理的植株为对照，挑选茎粗、叶面积变大、节间距变短的植株作为变异株，计算诱导率。诱导率=(变异植株数/成活植株数)×100%。

细胞学鉴定。参考王炜等[11]的方法进行压片。使用Leica DM4000显微镜观测黄连木染色体的数量并拍照记录。

流式细胞仪鉴定。参照徐鹏飞等[21]方法。选取叶色加深、叶片加大加厚等有明显表型变异的植株，取幼嫩新鲜叶片加入细胞解离液用刀片快速将叶片剁碎，过滤染色5 min后在LSRFortessa流式细胞仪上进行检测。

气孔和保卫细胞大小测定。参考谢兆森等[22]采用指甲油涂抹撕取法。用Olympus BH-2光学显微镜在40倍物镜下观测气孔和保卫细胞的长度和宽度，并统计气孔数量。

株高和叶形指数的测定。选取二倍体和四倍体植株各5株，分别测量它们的株高、叶长、叶宽和叶片厚度；并各选取5片叶子用Digimizer软件测量它们的面积。

叶片色素质量分数和净光合速率的测定。参照邹琦[23]的方法用体积分数95%的乙醇提取法进行测定。参照贾文飞等[24]的方法，在晴天09:00—11:00选取长势良好的二倍体和四倍体植株各3株，然后每株选取中部的成熟叶片使用CIRAS-3便携式光合测定系统进行测定，重复3次。

1.3 数据处理

采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，Duncan法进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量分数秋水仙素对黄连木种子诱导的影响

由表1可知，黄连木种子的出苗率、相对出苗率和成苗率均与处理质量分数和时间呈负相关关系，而诱导率随着时间和质量分数的增加而逐渐升高。在同一处理时间下，随着处理溶液质量分数的增加，出苗率、相对出苗率和成苗率逐渐降低；在同一处理质量分数下，随着处理时间增加出苗率、相对出苗率和成苗率逐渐降低。且处理质量分数越高，处理时间越长，降低地越快。如在处理时间为48h时，各处理质量分数下的出苗率从54.67%下降到16.00%，相对出苗率从99.99%下降到36.36%，成苗率从54%下降到14%；在0.3%处理质量分数下，出苗率从28%下降到16%，相对出苗率从51.22%下降到36.36%，成苗率从23.33%下降到14.00%。由此可知，处理时间越长，处理溶液质量分数越高，秋水仙素的毒害作用越大，出苗率、相对出苗率和成苗率就越低，而诱导率在0.3%质量分数下处理48 h达到最大值38.10%。因此，从黄连木的变异率来看，0.3%的秋水仙素溶液处理48 h为最佳组合。

表1 不同质量分数秋水仙素处理对黄连木种子的诱变效果

以秋水仙素质量分数为自变量x，以相对出苗率为因变量y，得到关于两者的多项式回归方程，如表2。在处理时间12、24、36、48 h下的半致死质量分数分别为0.31%、0.25%、0.23%、0.18%。

表2 秋水仙素处理黄连木种子的半致死质量分数

2.2 诱变株的筛选与鉴定

2.2.1 形态学鉴定

诱变株与对照株形态特征的比较如表3所示。由表3可知，诱变株的茎粗比对照株增加了27.15%，与对照株相比有极显著差异(P<0.01)，推测秋水仙素加倍成功的植株比对照株的茎粗大；诱变株的节间距比对照株小73.01%，与对照株相比有极显著差异(P<0.01)，推测秋水仙素有缩短植株节间距的作用；诱变株的叶面积比对照株大48.07%，且与对照株相比有极显著差异(P<0.01)，推测秋水仙素加倍成功的植株其叶面积较大。

2.2.2 根尖染色体计数鉴定

通过压片法对对照(二倍体)和诱变株进行染色体数目观察(如图1)。由图1可知，黄连木二倍体植株的染色体数为2n=30条，加倍成功的染色体数为4n=60条。

表3 黄连木诱变株与对照株形态特征的比较

2.2.3 不同倍体细胞DNA含量比较

流式细胞仪检测细胞DNA含量的结果如图2所示。由图2可知，诱变植株的细胞DNA含量与对照植株(二倍体)存在明显差异。对照植株(二倍体)荧光强度吸收主峰在50k(k=1 000)左右(图2a)，四倍体荧光强度吸收主峰在100k左右(图2b)，是对照植株(二倍体)细胞DNA含量的2倍，非整倍体在50k和100k左右均出现吸收主峰的部分植株(图2c)。经流式细胞仪检测倍性，除去出现双峰的非整体植株，共获得8株四倍体植株。

2.3 二倍体和四倍体植株的比较

气孔和保卫细胞大小。二倍体和四倍体的气孔及保卫细胞如表4及图3。由表4此可知，四倍体的气孔长是二倍体气孔长的38.19%，气孔宽是二倍体的61.38%，保卫细胞长是二倍体的35.35%，保卫细胞宽是二倍体的63.31%，气孔数量是二倍体的89.52%。二者之间均存在极显著差异(P<0.01)。

由图3可知，秋水仙素处理得到的四倍体植株的气孔和保卫细胞都比二倍体的大，单位面积内的气孔数量比二倍体植株的少。

表4 气孔及保卫细胞大小的比较

二倍体和四倍体植株株高和叶形指数。由表5可知，秋水仙素对植株有矮化作用,四倍体植株的株高比二倍体植株小，同比减少了35.88%，且两者有极显著差异(P<0.01)；四倍体植株的叶长与二倍体植株的叶长无显著差异(P>0.05)；四倍体植株比二倍体植株的叶宽大，同比增加了53.42%，有极显著差异(P<0.01)；四倍体植株的叶面积较二倍体植株大，同比增加了95.08%，且有极显著差异(P<0.01)；四倍体植株比二倍体植株的叶片厚，同比增加了72.95%，且有极显著差异(P<0.01)。

表5 二倍体和四倍体植株株高和叶形指数的比较

二倍体植株与四倍体植株的叶绿素质量分数和净光合速率如表6所示。四倍体植株的叶绿素质量分数和光合速率均高于二倍体植株，分别是二倍体植株的1.8和2.6倍，说明四倍体植株的叶片具有更好的光合特性。

表6 二倍体和四倍体植株叶绿素质量分数和净光合速率的比较

3 讨论

秋水仙素是诱导多倍体最有效的方法之一，适宜质量分数和处理时间可成功诱导出多倍体植株，质量分数过高时间过长会增加材料的死亡率，通常认为在半致死质量分数下的诱导率最高。李映乐等[20]用秋水仙素溶液浸泡人参果组培苗时发现0.2%和0.4%处理26 h死亡率都达到100%，0.2%处理18 h的变异率最高，为53.33%，成活率为50%，接近半致死质量分数；潘红兵等[17]用0.3%的秋水仙素溶液浸泡萌动紫美石榴萌动种子时发现处理时间为36 h时成活率最低为67.22%，筛选的最佳处理为0.3%的秋水仙素溶液处理24 h，四倍体诱导率为1.11%；张虹等[25]的研究结果表明，0.1%的秋水仙素处理24 h黑果枸杞萌动种子的诱导率最高为33.33%。而本研究的结果表明，通过回归方程计算在12、24、36和48 h下的半致死质量分数分别为0.31%、0.25%、0.23%和0.18%；0.3%的秋水仙素溶液浸泡48 h诱导效果最佳，其诱导率可达38.10%。

多倍体的鉴定方法主要有形态学鉴定、细胞学鉴定、流式细胞仪鉴定及生理生化法鉴定[26]。形态学鉴定依据植株的茎粗、节间距以及叶面积等进行鉴定，本研究初步从形态学对诱变株进行了筛选，获得了节间距短、茎粗较粗、叶面积较大的变异株，与任雪羽等[27]的形态学筛选方法一致。后期鉴定诱变成功的四倍体植株株高较矮、叶片较宽较厚。四倍体植株的株高普遍比对照株矮，这可能是因为在前期生长的过程中，秋水仙素具有毒性所以四倍体植株生长速度缓慢，待后期恢复生长后则会迅速超越对照株的生长速度。形态学的鉴定方法简单快捷，但结果不会太准确，因此还需进一步进行鉴定。

染色体计数可以精确直观地鉴定出植株的倍性。本研究在形态学初步筛选基础上，选取了表型变异的植株进行了细胞染色体数。染色体计数分析结果表明，黄连木二倍体植株的染色体数2n=30，四倍体植株的染色体数4n=60，四倍体植株的染色体数(2n=60)是二倍体植株(2n=30)的2倍。但黄连木的染色体较小，在制片时难以压到同一个平面上，计数困难。而流式细胞仪可简单快捷准确地鉴定出植株的倍性，且已被广泛应用于植株的倍性鉴定[25，27-28]。本研究对变异植株的流式细胞仪鉴定结果表明，诱变植株群体有二倍体、混倍体和四倍体3种类型。二倍体植株的DNA相对含量在50k处有一道峰值，四倍体植株的DNA相对含量在100k处有一道峰值，而嵌合体植株的DNA相对含量在50k和100k处均有峰值。

气孔密度、保卫细胞大小以及光合速率高低是鉴定多倍体的常用指标。与黄连木二倍体植株相比，本研究鉴定的四倍体植株具有气孔密度变小、保卫细胞变大的特点[29]。四倍体植株叶片叶绿素含量和净光合速率均显著高于二倍体植株，说明上述形态和生理指标均可用于黄连木诱变植株的多倍体鉴定[30-32]。

4 结论

多倍体育种是一种创建新种质资源的重要方法。本研究利用秋水仙素对黄连木萌动种子进行诱变处理，通过形态学、细胞学和流式细胞仪等方法对处理后的植株进行了多倍体鉴定。结果表明，0.2%的秋水仙素溶液浸泡36 h和0.3%的秋水仙素溶液浸泡12 h为诱导黄连木萌动种子的最佳组合。成功诱导鉴定的8株四倍体变异株与二倍体植株相比，表现为茎变粗、节间缩短、叶色加深、叶片增大增厚，气孔变大、密度变小，叶绿素质量分数增加和光合速率增大的特征。综上，用秋水仙素处理黄连木萌动种子可成功诱导出黄连木四倍体植株，此方法可为黄连木四倍体新品种的选育提供参考。