基于HPLC法考察5种赋形剂对双柏散制成糊剂有效成分的影响*

蓝鲜艳，张洪平，卢鲜云，郑厚平，梁学政

（柳州市中医医院，广西 柳州 545001）

双柏散是广东省已故名老中医黄耀燊的经验方，由大黄、侧柏叶、黄柏、泽兰、薄荷5味药材组成。方中诸药合用，共奏活血化瘀、清热解毒、消肿止痛之功，切中急性软组织损伤、疮疡、急腹症的病机，对局部损伤的红肿热痛、创面感染等诸症有良效[1]。目前本方多用于治疗静脉炎[2]、痛风性关节炎[3]、盆腔炎[4]、癌症疼痛[5]等多种疾病。现代药理研究[6-8]证实本方具有良好的抗炎、止痛作用。蒽醌类、生物碱、黄酮类、挥发油、鞣质等成分均是双柏散抗炎、消肿、止痛、抑菌作用的化学物质基础[9]。《中医药单用/联合抗生素治疗盆腔炎性疾病临床实践指南》、相关文献、临床调查等显示双柏散外敷的具体用法、用量尚未明确，使用赋形剂不同，可能影响其临床疗效[10]。因药物疗效与所含有效成分含量有关[11]。在中药复方制剂质量标准研究中，中药指纹图谱因基于光谱及色谱法可加强分离性及检测能力，逐渐成为较为主流的检测模式。高效液相色谱法（HPLC法）精密度及重现性等相对较高，在当前中药复方制剂质量控制中常被使用[12]。如雷秀星等[13]采用HPLC法同时测定中药复方中多种化学成分的含量。前期调查发现，不同的临床科室根据用药习惯选择使用蜂蜜水、姜汁、白糖水、醋、水等不同辅料调制双柏散成黏度适中糊剂外敷患处或穴位。为确保所配制糊剂药品质量，多数科室采用现配现用，最长置冰箱冷藏不超过24 h。由于不同辅料可影响药品质量[14]，本课题组为考察不同辅料对双柏散药品质量的影响，使用HPLC法测定临床常用赋形剂（蜂蜜水、姜汁、白糖水、醋、水）调制双柏散制成糊剂后小檗碱、大黄素的含量，现将结果汇报如下。

1 材 料

1.1 仪器Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪、Waters2998型紫外检测器、EmPower色谱工作站（美国沃特世公司）；CF225D型电子天平（德国赛多利斯集团）；JY2002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HK250型科导台式超声波清洗器（上海汉克科学仪器有限公司）；800Y型高速多功能粉碎机（武义海纳电器有限公司）。

1.2 药物与试剂双柏散（批号：20200601）由柳州市中医医院制剂室提供；小檗碱对照品（批号：MUST-19072501，含量：98.38%）、大黄素对照品（批号：MUST-19100810，含量：98.73%）均购自中国科学院成都生物研究所；乙腈为色谱纯（湖北弗顿科学技术有限公司）；其他试剂均为分析纯；实验用水为超纯水；蜂蜜（批号：20200412）购自广西蜜博士蜂业有限责任公司；白糖（批号：20210407）购自柳州市柳冰食品厂；醋（批号：20200828）购自柳江县耀元调味食品厂；生姜汁（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流动相：溶剂A为乙腈，B为0.4%磷酸水（0～5 min，12%A；5～10 min，12%A～20%A；10～18 min，20%A～27%A；18～25 min，27%A～31%A；25～30 min，31%A～65%A；30～40 min，65%A），梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为275 nm，柱温为26℃，进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 样品的制备 取双柏散50.00 g，加入110 mL蜂蜜水（V蜂蜜∶V水=1∶10），搅拌均匀，即得蜂蜜调制糊剂样品（以下简称蜂蜜组）。同法分别加入110 mL糖水（V白糖∶V水=1∶10）、姜汁（V姜汁∶V水=1∶10）、醋、水，制备蜂蜜调制糊剂样品（以下简称蜂蜜组）、糖水调制糊剂样品（以下简称糖水组）、姜汁调制糊剂样品（以下简称姜汁组）、醋调制糊剂样品（以下简称醋调组）、纯水调制糊剂样品（以下简称水调组）。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取小檗碱1.32 mg、大黄素0.33 mg，混合置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得小檗碱、大黄素质量浓度分别为0.026 4、0.006 4 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取蜂蜜组样品5.00 g，置具塞三角瓶中，加入50 mL甲醇，称定质量，超声提取30 min，提取2次，取出放凉并称定质量，用甲醇补足减轻的质量，摇匀、滤过，取续滤液即得蜂蜜组供试品溶液。同法制备糖水组、姜汁组、醋调组、水调组供试品溶液。

2.2.4 阴性对照品溶液制备 按双柏散处方比例和制备工艺，制备缺大黄、黄柏的阴性对照品，按照“2.2.1”“2.2.3”项下制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，注于高效液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定。结果供试品溶液色谱图中的积分峰与混合对照品溶液中的积分峰一一对应，阴性对照品溶液色谱图中没有出现相应保留时间的峰，表明该方法的专属性良好。（见图1）

图1 HPLC图

2.3.2 线性关系考察 精密称取小檗碱0.88 mg、大黄素0.22 mg，混合置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得小檗碱、大黄素质量浓度分别为0.017 6、0.004 3 mg/mL的对照品溶液。依次配制至0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75倍，制得小檗碱质量浓度为0.0088、0.013 2、0.017 6、0.022 0、0.026 4、0.035 2 mg/mL，大黄素 质 量 浓 度 为0.002 2、0.003 2、0.004 3、0.005 4、0.006 4、0.008 6 mg/mL的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算含量。以质量浓度（x，mg/mL）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，求得小檗碱、大黄素回归方程分别为：y=21 614x-14.509（r=0.999 7），y=32 223x-4.054 7（r=0.999 4）。结果表明小檗碱在0.008 8～0.035 2 mg/mL、大黄素在0.002 2～0.008 6 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.3”项下蜂蜜组供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果小檗碱、大黄素对照品峰面积的RSD分别为0.11%、0.23%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取“蜂蜜组”双柏散样品适量，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、16、24 h后，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录小檗碱、大黄素峰面积。结果小檗碱、大黄素峰面积的RSD值分别为0.65%、0.18%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取“蜂蜜组”双柏散样品适量，按“2.2.3”项方法制备双柏散供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录小檗碱、大黄素峰面积。结果小檗碱、大黄素峰面积的RSD值分别为1.41%、0.49%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取同批“蜂蜜组”双柏散样品12份，每份约2.50g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入0.6788mg/mL、0.142 5 mg/mL的小檗碱、大黄素对照品1 mL，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，计算小檗碱、大黄素加样回收率。（见表1）

表1 加样回收率实验结果（n=6）

2.4 不同辅料组供试品溶液中小檗碱和大黄素测定结果采用软件SPSS22.0进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，若数据符合正态性检验，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。与水调组比较，蜂蜜组、醋调组、姜汁组、糖水组双柏散提取物中小檗碱含量均明显降低（P＜0.05）；与蜂蜜组比较，姜汁组双柏散提取物中小檗碱含量明显降低（P＜0.05），糖水组双柏散提取物中小檗碱含量明显升高（P＜0.05）；醋调组双柏散提取物中小檗碱含量与蜂蜜组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组小檗碱含量高低排序：水调组＞糖水组＞蜂蜜组=醋调组＞姜汁组。

与水调组比较，蜂蜜组双柏散提取物中大黄素含量明显升高（P＜0.05），醋调组、姜汁组、糖水组双柏散提取物中大黄素含量均明显降低（P＜0.05）；与醋调组比较，姜汁组、糖水组双柏散提取物中大黄素含量均明显升高（P＜0.05）；与姜汁组比较，糖水组双柏散提取物中大黄素含量明显降低（P＜0.05）。各组大黄素含量高低排序：蜂蜜组＞水调组＞姜汁组＞糖水组＞醋调组。

表2 各组双柏散提取物中小檗碱和大黄素含量比较（±s，n=5，mg/g）

表2 各组双柏散提取物中小檗碱和大黄素含量比较（±s，n=5，mg/g）

注：与水调组比较，aP＜0.05；与蜂蜜组比较，bP＜0.05；与醋调组比较，cP＜0.05；与姜汁组比较，dP＜0.05

组别 小檗碱 大黄素水调组 0.309 3±0.007 1 0.045 5±0.000 5蜂蜜组 0.271 5±0.000 5a 0.057 0±0.000 1a醋调组 0.270 2±0.009 0a 0.032 8±0.001 1a姜汁组 0.256 9±0.003 1a b 0.042 1±0.000 5a c糖水组 0.295 1±0.010 2a b 0.040 3±0.000 5a c d

3 讨 论

3.1 供试品溶液制备方法的考察本实验在制备供试品溶液时考察了纯净水、乙醇、甲醇溶液的提取效果，结果显示，甲醇提取的供试品溶液色谱峰响应值较大。结合文献[15-16]报道双柏散方中的大黄素、小檗碱在甲醇中溶解度较好，综合考虑，选择甲醇作为本试验提取溶剂。目前双柏散制成糊剂的黏稠度、使用液体辅料的比例尚无准确参考数值，在制备过程中，凭个人感官判断来决定使用液体辅料的剂量。但不同操作者，对黏稠度的感官可能存在差异，最终影响双柏散糊剂的有效成分含量。

3.2 测定指标的选择选择合理的中药质量控制指标用于评价及优化管理方案十分重要[17]。双柏散由大黄、黄柏、薄荷、泽兰、侧柏叶组成，具有抗炎作用[18]，可用于治疗各种炎症疾病[19]。大黄素、小檗碱具有抗炎、抑菌的作用[20]，因此，本研究通过采用HPLC法测定不同辅料（蜂蜜、糖水、醋、姜汁、水）对双柏散甲醇提取液中大黄素、小檗碱的含量，探讨不同辅料对双柏散的抗炎效果的影响。中药复方含有多种成分，可以多靶点、多途径、多方面改善临床症状[21]，后续可继续完善这些方面的研究。

3.3 检测有效成分含量方法的选择中药指纹图谱目前广泛用于评价中药及其成方质量，对于提高其质量标准有重要意义[22]。目前用于中药质量评价的指纹图谱有气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱法、超临界液体色谱、高速逆流色谱等，这些方法应用较广，发展前景好[23]。肖春霞等[24]使用HPLC法测定三黄片中的大黄素、小檗碱等成分，分离度良好。本研究利用HPLC法建立了同时测定双柏散中小檗碱和大黄素两种成分的方法，方法学的验证结果表明，该方法简便、准确，重现性好，为双柏散的进一步开发提供理论基础。本次测定小檗碱含量时，蜂蜜组、醋组测得结果没有显著性差异，后续可以通过使用前述其他方法进行检测对比。

3.4 临床应用价值使用蜂蜜、糖水、姜汁、醋、水不同赋形剂调制的双柏散糊剂甲醇提取溶液中主要成分大黄素、小檗碱含量存在差异。水调组和糖水组小檗碱含量相对较高，蜂蜜组和水调组大黄素含量相对较高。结合实际操作和赋形剂方便获取，综合判断，用水作赋形剂调制双柏散成糊剂，有效成分含量较高，经济实惠，适合临床使用。双柏散是复方成分，大黄素、小檗碱含量高的组，临床疗效不一定最好。外敷贴剂给药，除了关注复方中的有效成分含量，还须考虑有效成分透过皮肤被吸收的程度，只有有效成分得到很好吸收了，才能更好发挥治疗作用，所以下一步应进一步考察不同辅料对双柏散抗炎作用的影响。