圈养雌性大熊猫发情及排卵监测方法论述及展望

杨波, 赖燕舞, 周强, 成美玲, 唐丹, 程建斌, 李果, 周应敏, 罗波, 张贵权, 黄炎*

(1. 中国大熊猫保护研究中心，四川都江堰611830；2. 大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，四川都江堰611830)

大熊猫是我国特有的孑遗物种，具有重要的学术研究价值。为了稳定与发展大熊猫种群数量，除了保护野生大熊猫的栖息地外，还应强化完善饲养管理手段，科学促进圈养大熊猫的繁殖。1963年，世界上第一只大熊猫幼仔诞生于北京动物园。成功解决圈养大熊猫繁育中的“三难”问题(张和民，王鹏彦，2003)后，圈养种群数量快速增长，截至2020年全球圈养大熊猫数量已超过600只(https://www.forestry.gov.cn/main/5904/20210102/002252617123874.html)，为野化培训与放归奠定了扎实基础。大熊猫为季节性单次发情动物，一般在2—5月发情，发情配种期只有24～72 h，甚至更短。雌性大熊猫一般一年只排卵一次，有效监测排卵时间成为繁育成功的关键，也是圈养种群繁育的难点。国内外专家学者围绕大熊猫发情鉴定和排卵监测进行了多学科的探讨，包括行为学、细胞学、内分泌学、生物化学、微生物学、光谱化学和组织学等。本文旨在总结论述圈养雌性大熊猫发情鉴定和排卵监测的方法，并探讨可能出现及应用的新方法，以期为把握大熊猫发情配种的最佳时机提供更好的参考，为大熊猫圈养种群的繁育奠定一定的理论基础。

1 行为研究

1.1 雌性发情行为表现

国内外学者开展了大量雌性大熊猫的发情行为研究，为大熊猫的配种提供了更多、更可靠的行为数据(Bonney.，1982；曾国庆等，1984；Murata.，1986；Masui.，1989；黄翔明，叶志勇，1991；Swaisgood.，2003；张和民，王鹏彦，2003；陈琳，李果，2006；杨胜林等，2007；陈超，2015；Kersey.，2016；刘敏，2016)。大熊猫的发情期分为前期、高峰期和后期(曾国庆等，1984；张和民，王鹏彦，2003)。雌性在发情期的行为表现为：前期，食欲减退，活动量增加，开始有咩叫、蹭阴、戏水、嗅气味等行为，对雄性不感兴趣或带有攻击行为，随着发情继续，减食明显，活动量和活动时间明显增加，戏水、咩叫和蹭阴的频率增加，开始对雄性感兴趣；高峰期，食欲大减，对雄性的反应增强并主动接近雄性，见到雄性站立不动(呆立)或用臀部顶撞雄性，翘尾，作交配姿势，常伴有自慰行为，其中，翘尾(触碰时或自发)是最能体现雌性愿意接受交配的行为表现(Bonney.，1982；Murata.，1986；Masui.，1989；Laura.，2002)，这也可能是一个排卵信号的行为指示(Laura.，2002)；后期，所有发情表现逐渐消失，活动量减少，食欲逐渐恢复正常。

大多数雌性与雄性进行交配的时间发生在发情高峰期，一般持续1～3 d。但某些个体发情高峰期的行为表现时间很短，仅持续1～2 h(邓世全，陈猛，1997)，少数个体甚至未表现出明显的发情高峰期行为。由此可见，雌性发情行为有明显特征，对于发情行为典型的雌性大熊猫，观察其发情行为是判断发情程度的有效方法。

1.2 雄性发情行为表现

雄性为被动发情，当受到发情雌性求偶行为或特殊气味刺激后才被激发(邓世全，陈猛，1997)。雄性具有辨别雌性是否发情和是否处于发情高潮的能力，并根据雌性发情程度调节性兴奋强度(李德生等，2001；张和民，王鹏彦，2003)。在雌性发情前期，雄性会表现出轻度兴奋，如活动量增加、少量的标记和低频率咩叫；当雌性处于发情高峰期时，雄性会非常兴奋，不停地走动并发出频繁的咩叫求偶声，还时常伴有标记、戏水、尿频等行为，喜欢舔舐雌性尿液并且跟随和靠近雌性，有时还用前掌搔抓雌性臀部和尾部，可爬跨进行交配，某些雄性会露出阴茎(高凤歧等，1994；邓世全，陈猛，1997；李德生等，2001)。放对交配时，雄性爬跨雌性背部，进行“站立式”交配。阴茎插入后，将姿势调整为“坐抱式”直到交配结束。射精时，雄性会同步雌性发出低而粗、频率较高的咩叫。交配结束后，两者分开，雄性停止咩叫(王雄清，1987；胡锦矗，魏辅文，1989；高凤歧等，1994)。因此，可以根据雄性发情行为表现来辨别雌性发情程度和确定配种时机。对能进行自然交配的个体，在实践中综合雌性与雄性的发情行为表现，可以较直观地判断雌性发情程度并指导适时配种。

1.3 发情通讯行为

动物经过长期的繁殖进化已形成一种雌雄能相互识别交配行为的特殊信号。大熊猫在生活中常用化学通讯与听觉通讯2种通讯方式(Schaller.，1985)。大熊猫的肛周腺和尿液中携带有关年龄、性别、社会地位和亲缘关系等用于个体识别的信息(Swaisgood.，2002；White.，2004；Liu.，2006；Tian.，2007；Liu.，2008)。大熊猫的咩叫和鸟叫声中也携带了关于身份、亲缘关系及发情状态等信息(北京动物园，1974；Kleiman & Peters，1990；Charlton.，2009a，2009b，2010)。大熊猫在发情时会利用嗅觉、视觉和听觉进行交流，多模式信号(化学信号和声音信号)是提示雌性发情程度及排卵的最佳预测器(Owen.，2016)。徐蒙等(2011)也证实了大熊猫通过标记行为做出对声音信号(异性的叫声)刺激的行为响应。大熊猫在求偶期间会使用多模态信号宣传发情及生理状况，并在更长的时间促进影响潜在的配偶(Owen.，2013)。因此，随着雌性发情程度的递进，雌雄个体都会交替地表现出咩叫、鸟叫和标记等行为(黄翔明，叶志勇，1991；Swaisgood.，2000；张和民等，2000；李德生等，2001)。

大熊猫在发情期拥有较为复杂的声音类型，是性行为的一种直接表达。有6～12种声音与发情相关，包括咩叫、鸟叫、狗吠、嗥叫、嗷嗷叫、咆哮、哼叫等(朱靖，孟智斌，1987；张和民，王鹏彦，2003；周小平等，2005；徐蒙等，2011)。其中，咩叫和鸟叫属于非攻击性、表达友好亲近的叫声，在交配季节可用于吸引异性和协调雌雄同步发情(Kleiman & Peters，1990)。

有关雌性大熊猫咩叫行为的研究最多，咩叫常用来鉴定雌性发情程度及判断配种时间(北京动物园，1974；曾国庆等，1984；朱靖，孟智斌，1987；黄翔明，叶志勇，1991；邱贤猛，1993；Lindburg.，2001；Charlton.，2009a；徐蒙等，2011)。研究表明，随着发情高峰期的到来，雌性咩叫的音调和持续时间会增加(Lindburg.，2001)；高峰期的频率可达22～51次/10 min(曾国庆等，1984；朱靖，孟智斌，1987)或33.2～83.2次/10 min(黄翔明，叶志勇，1991)。咩叫高峰常发生在自然交配时或交配后(朱靖，孟智斌，1987；黄翔明，叶志勇，1991；邱贤猛，1993)。发情后期的咩叫明显减少或无，频率会下降至0～1次/10 min(曾国庆等，1984)。

雌性大熊猫的鸟叫也含有表明其发情程度的潜在信号，叫声频率和声学特点可以表征其发情和排卵状态(Charlton.，2010)。雌性会在交配前1周开始鸟叫，在交配前2 d出现峰值，直到交配后2 d都会出现较高的频率(Zhang.，2004)。声学分析发现，具有生育能力的雌性鸟叫持续时间较长，具有较高的抖动和刺耳性。叫声抖动的增加可能是排卵前雌激素增加所致(Lindburg.，2001；Charlton.，2010)。Charlton等(2010)也证实了具有生育能力与不具有生育能力的雌性所发出的鸟叫存在声学差异，雄性倾向于具有生育能力雌性所发出的鸟叫。因此，雌性发出高频率的叫声可能是为了吸引雄性，引起雄性产生强烈性欲并与其顺利完成交配。因此也可将鸟叫视为雌性处于发情高峰或排卵期的重要信号。

除了叫声行为以外，标记也是一种通讯方式。雌性大熊猫的化学信号主要通过蹭阴(尿液或肛周腺分泌物标记)的方式传播。蹭阴遗留物中含有大量用于生殖联系的气味信息，能够促使雌、雄生理与发情行为同步，作交配前准备。因此，雌性会通过蹭阴来预示其发情期的到来，以达到吸引雄性的目的。雌性蹭阴主要发生在交配前，高峰期一般发生在咩叫高峰期前，频率可达60～106次/100 min(黄翔明，叶志勇，1991)。随着发情递进，蹭阴频率逐渐增加，在交配发生前的1～5 d达到顶峰，而雌性很少会在交配时或交配后再发生该行为(Murata.，1986；Lindburg.，2001；Laura.，2002；Swaisgood.，2003；Zhang.，2004)。

从前人研究成果及实践应用中发现，量化叫声和标记行为，根据叫声或行为的频率强度来推测及判断雌性的发情高峰期或排卵时间。但目前存在研究个体不足、数据量偏少、研究结果有偏差和个体差异性等现状，不足以建立一个较为精确的评估标准，值得深入研究。

2 外阴形态及阴道细胞学研究

2.1 外阴形态

雌性外阴(外生殖器官)形态会在发情期发生特殊性变化，与发情程度存在关联性。雌性外阴的颜色、水肿程度及开口大小是主要的发情鉴定指标。综合相关文献(邱贤猛，1987，1988；施少清等，1988；Durrant.，2003；陈琳，李果，2006；周应敏等，2013，2020；刘敏，2016)得出：雌性在发情前期，外阴呈粉红色或浅红，外翻及开口程度小；随着发情继续，色红而潮润，阴门开始红肿并逐渐显著，阴道黏膜肿胀，开口逐渐张至最大；发情高峰期，色呈玫瑰红，阴道黏膜肿胀但松弛，开口外翻程度有开始变小的趋势，有分泌物流出；发情后期，红色褪去偏白，阴门红肿消失，开始回收、缩小。将雌性外阴形态与发情行为结合来判断大多数圈养雌性大熊猫断发情程度或选择配种时间仍然是一个简捷而有效的方法。

2.2 阴道细胞

汤纯香等(2000)描述了雌性大熊猫阴道细胞(文中所称“阴道”实际为“尿生殖前庭”)的形态学变化：非发情期的细胞呈深蓝色，细胞与细胞核均很小；发情前期的细胞呈蓝色而略带粉红，细胞核仍很小。随着发情发展，细胞大多数呈粉红色，多边形，细胞与细胞核开始膨大渐至破裂；发情高峰期的细胞大多数呈橙黄色，细胞角质化，细胞核消失，呈多边形且很薄。Durrant等(2002，2003)利用巴氏染色法染色阴道细胞后得出：在排卵前 8～9 d，大部分脱落的阴道细胞由嗜碱性(蓝色)转变为嗜酸性(粉红色)，没有伴随核或细胞质变化；排卵前2 d，大多数阴道细胞由角质化(橙色)细胞取代嗜酸细胞。

阴道细胞在发情期会角质化，而且细胞角化率会随着发情程度的推移呈现出同步增长的趋势。因此，阴道细胞角化率对大熊猫发情鉴定及配种时机确定具有良好的指示性，在早期大熊猫生产中得到过很好的验证和应用(潘秀森等，1984；陈玉村等，1985；邱贤猛，1987，1988，1993；陈猛等，1998；汤纯香等，2000；Durrant.，2002，2003)。在发情期多数雌性大熊猫的阴道细胞角化率会从非发情期的35%以下(汤纯香等，2000)，上升至60%及以上(陈猛等，1998；汤纯香等，2000)。在发情高峰期或自然交配时，阴道细胞角化率最高，上升至70%及以上，有的甚至可达97%(邱贤猛，1987，1988，1993；陈猛等，1998；汤纯香等，2000；Durrant.，2002)。但阴道细胞角化率分析存在个体差异，有报道显示最高角化率只有55%左右(潘秀森等，1984；邓世全，陈猛，1997)，甚至还有 1例异常：发情个体在整个发情期的角化率并未发生变化，均小于20%(周应敏等，2013)。不仅如此，上述研究中的采样频率为每日一次，这或许能够满足参与自然交配个体的配种，但这样的采样频率在人工授精(artificial insemination，AI)中偏低。

通过外阴形态变化和阴道上皮细胞角化率，能判断雌性大熊猫的发情程度，但外阴形态的判断很大程度依赖观察者的经验，阴道上皮细胞角化率监测也受限于较为困难的频繁采样。因此，这2种判断方法在繁殖生产中有效，但在应用上会受到一定程度的限制。

3 内分泌

3.1 类固醇性激素

类固醇性激素与动物繁殖密切相关，性激素的变化对生殖系统的活动具有调控作用，性激素水平可以反映出性腺的活动规律及繁育状态(Lasley & Kirkpatrick，1991)。目前对发情期雌性大熊猫的类固醇性激素研究集中于雌性激素：雌酮-3-葡萄糖醛酸苷(E1G)、雌酮-3-硫酸盐、17β-雌二醇以及雌三醇(李复东等，1993；Laura.，2002；Narushima.，2003；杨胜林等，2007；Kersey.，2010；Wauters.，2018；沈洁娜等，2020)和孕激素：孕酮、孕二醇-3-葡萄糖苷酸(Monfort.，1989；彭世媛，叶志勇，1993；Narushima.，2003；Hama.，2009)。早期主要利用放射免疫测定法(radio immunoassay，RIA)测定大熊猫血清及尿液中性激素水平(Bonney.，1982；曾国庆等，1984；李复东等，1993；谢钟等，1994；Lindburg.，2001；Narushima.，2003；Owen.，2005；MacDonald.，2006)。RIA的局限性在于：使用放射性元素，不仅对实验人员及环境产生一定的危害，而且对实验室及实验人员的要求较高，价格较昂贵(邓涛等，2013)。酶联免疫分析法(ELISA)逐渐替代RIA，且研究也证实了ELISA与RIA所得出的结果存在一致性(黄炎等，2001)。因此，ELISA被广泛应用到大熊猫尿液、粪便、毛发等非损伤性样品的类固醇性激素水平测定中，尤其被应用在大熊猫尿液类固醇性激素水平的测定，为大熊猫发情配种及排卵监测提供了可靠的技术支持(彭世媛，叶志勇，1993；黄炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；杨胜林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；刘敏，2016；Wauters.，2018；沈洁娜等，2020)。

在雌性大熊猫发情期，无论是血清中雌激素水平还是尿液中雌激素代谢产物含量均呈现出“缓升快降”的变化，即雌激素随着发情开始从基础水平缓慢上升，直到峰值的出现，随后剧降至基础水平(Bonney.，1982；曾国庆等，1984；施少清等，1988；彭世媛，叶志勇，1993；Laura.，2002；喻述容等，2003；杨胜林等，2007；Kersey.，2010；沈洁娜等，2020)。雌激素对发情行为具有触发作用，且雌激素在排卵前似乎能够很好地预测发情行为(Chaudhuri.，1988；Lindburg.，2001；Hama.，2009)。雌性发情高峰期发生在雌激素峰值出现的前1 d、当日或激素峰后第1天，最高的配种率均发生在雌激素峰后(Bonney.，1982；Monfort.，1989；彭世媛，叶志勇，1993；冯文和等，1994；Lindburg.，2001；董武子，窦忠英，2003；Czekala.，2003；杨胜林等，2007；Huang.，2012a；刘敏，2016；沈洁娜等，2020)。雌性大熊猫的自然交配或AI时间应控制在雌激素峰出现的当日或之后的第1～3天(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾国庆等，1990；李复东等，1993；彭世媛，叶志勇，1993；谢钟等，1994；董武子，窦忠英，2003；Czekala.，2003；杨胜林等，2007；Huang.，2012a，2012b)。

除此以外，孕激素从雌性发情开始一直处于最低水平，在雌激素峰前或峰后开始上升，随后保持在一个较高的水平，直到产仔后才降至基础水平(曾国庆，刘维新，1994；Laura.，2002；Kersey.，2010；沈洁娜等，2020)。因此配种时间应选择在雌激素下降且孕激素逐步升高期间(李复东等，1993；沈洁娜等，2020)。有研究指出，大熊猫在排卵后孕激素的分泌量会大量增加(Monfort.，1989)。雌激素峰后第7天的孕激素水平是基础水平的4倍，孕激素水平可作为确定排卵的方法(Czekala.，2003)。

雌激素和孕激素的变化趋势只能明确大熊猫的排卵发生在雌激素峰后和孕激素上升的这段时间，但不能确定排卵与雌激素峰发生的时间关系(Lindburg.，2001)，或许可以通过配种时间与受孕情况的相关性来探讨。喻述容等(2003)根据成都大熊猫繁育研究基地1997—2001年39例大熊猫繁殖情况，得出雌激素峰后12 h内进行首次自然交配、AI或混合配种，受孕率达100%；峰后12～24 h，受孕率为83.3%；峰值下降24 h后，受孕率为0。根据中国大熊猫保护研究中心2017年繁育情况总结得出：雌激素峰后12 h内，受孕率为84.6%(=13)；峰后12～24 h，受孕率为75%(=8)；峰值下降24 h后(≤37.8 h)，受孕率为85.7%(=7)(内部资料)。大熊猫的生育窗口期定义为雌激素峰值后的48 h内，在此期间需要进行自然交配和/或AI 1次或2次(Kersey.，2016)。侯蓉等(2012)报道在雌激素真实峰出现后24～48 h内进行首次AI，完成后6～8 h进行第二次AI，妊娠率可达42.11%。Huang等(2012a)在2004—2010年对 14只成年雌性进行AI，首次在雌激素峰值当天，受孕率为75%，在峰后第1天内的受孕率为29%，超过1 d的受孕率为0，整体为25%。沈洁娜等(2020)也报道首次AI平均时间为雌激素峰后29.8 h的受孕率高达46.7%(=16)。

雌激素可以直接反映卵泡发育程度，且不易受外界因素影响，其监测较为准确、稳定。雌激素监测在大熊猫发情配种实践中得到广泛应用，并获得了较好的监测效果。该方法促使自然交配的受孕率达75%以上，AI的受孕率在25%以上，甚至有接近50%的受孕率。目前国内外研究机构均将雌激素峰发生时间作为定义大熊猫生育窗口期的主导时间指标，并将该方法应用于指导适时配种。

3.2 促黄体生成素(LH)与促卵泡激素(FSH)

LH与FSH均是由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素，受下丘脑促性腺激素释放激素控制，同时也受卵巢的正负反馈调控。LH对卵泡发育成熟和卵母细胞发育潜力获得具有重要作用。FSH可促进卵泡颗粒层细胞增生分化，并促进卵巢发育。LH和FSH是调控卵泡生长的主要激素。类固醇性激素的产生依赖LH和FSH的协同作用，卵子的成熟和排出与LH 密切相关。

早期有学者利用生物测定法(施少清等，1988；曾国庆等，1990)和碘标人类LH双抗法(林增云，1991)测定大熊猫LH含量。分析得出，血清LH峰与血清雌激素峰出现在同一天或者后1～2 d，而尿液LH峰与血清LH峰在同一天或后1 d出现(施少清等，1988；曾国庆等，1990)，尿液LH峰与尿液雌激素峰在同一天(施少清等，1988；林增云，1991；周杰珑等，2007)或后 1～2 d出现(曾国庆等，1990；周杰珑等，2007)。综上，LH峰在雌激素峰后发生，并且在雌激素峰出现的当日或峰后1～2 d发生。

随着ELISA的研发，LH的测定更方便、快捷。蔡志刚等(2010)利用与大熊猫同源最高动物的商业化ELISA试剂盒测定大熊猫尿液LH，发现LH峰与雌激素峰相差±8 h(产仔个体=4)，或者LH峰在雌激素峰后15～26 h出现(非产仔个体=2)。蔡开来等(2016)发明大熊猫LH检测试剂盒并提供了检测方法，通过尿液LH检测可以实现对大熊猫发情及排卵的监测。随后，Cai等(2017)发现大熊猫个体间LH峰和雌激素峰的间隔时间不同，但尿液LH峰总是在雌激素峰之后出现，大多数产仔雌性在LH峰后10 h内(受孕率为85.71%)或10～28 h(受孕率为33.33%)进行首次AI，尿液LH峰出现在雌激素峰后11.2 h±5.4 h(怀孕组)和14.8 h±7.4 h(非怀孕组)，LH大量分泌标志着排卵的发生，LH峰出现时间最适宜进行自然交配或AI。

测定发情期雌性大熊猫尿液FSH含量发现，从基础值到峰值的间隔期约10 d，此持续时间即为大熊猫的卵泡期(约10 d)；同时，尿液FSH峰与尿液雌激素峰出现的时间一致(Monfort.，1989)。

与大熊猫类固醇性激素研究相比，LH与FSH的研究和报道较少、深度与广度不够，但在未来有很大的应用前景，需要继续研究。

4 生化分析

繁殖季节大熊猫肛周腺及尿液中很可能含有触发生殖行为或与生殖有关的挥发性物质。刘定震等(2003)利用气相色谱-质谱联用技术检测大熊猫尿液中挥发与半挥发性物质，发现性活跃的雄性尿液中含有更多挥发性强、相对分子质量小的酸性物质，在整个繁殖期的挥发性成分较非繁殖期多。发情期雌性尿液中的中链脂肪酸含量随雌激素增加而增加(Dehnhard.，2006)。进一步研究发现，雌性尿液中癸酸含量随雌激素升高而显著上升，进而激发雌性的发情行为，表明该物质可能作为一种信息素来让雌性吸引雄性，在排卵前会及时释放(Dehnhard.，2016)。

刘俊英等(2000)已证实气相色谱-质谱联用技术也可以被应用于大熊猫肛周腺性外激素的检测。郭俊良(2020)研究显示，发情期雌性肛周腺分泌物中含有122种化合物，其中2种脂肪酸酯(ethyl oleate和ethyl9-hexadecenoate)呈现出显著差异性，并随着发情的推进显著增加，表明这2种化合物可能是雌性大熊猫处于发情期特殊信号物，与发情状态存在一定的关联性。

大熊猫体液(尿液和肛周腺)生化的研究进展较缓慢，研究深度不够，无法建立标准化的评估体系，且测试时间较长、费用较高。目前尚不能直接应用在大熊猫适时配种上，但在大熊猫繁殖生理学研究中起着重要的作用，需要进一步研究。

5 微生物

生殖道内的微生态系统是维持生殖道内稳态以及抵御外来有害病原重要的非特异性免疫系统，可以有效防御生殖道感染。雌性大熊猫的生殖道感染会引起繁殖障碍，甚至流产。早期已有学者对非发情状态下雌性大熊猫生殖道内的菌落结构做了探究(雷蕾等，2001；胡国全等，2005)。刘燕等(2012)发现，在发情高峰期AI时阴道黏液中的链球菌属、乳酸杆菌属和大肠杆菌为主要菌群。马晓平等(2016a，2016b)在发情期雌性阴道分泌物中获得并鉴定出18株产HO的乳酸菌和30种真菌(包含25种霉菌和5种酵母菌)。近期也有研究表明，随着发情继续，雌性肛周腺中未分类假单胞菌属__和弯曲杆菌属等菌落的丰富度明显增加，而考克氏菌属、短状杆菌属、短杆菌属及葡萄球菌属等菌落的丰富度降低，推测发情期雌性会通过增加假单胞菌等和降低短杆菌、短状杆菌丰富度的方式，以增加固醇类及脂肪酸酯类化合物的合成，进而释放出发情期的气味信号，有利于增加与异性的交流机会，达到发情配种的目的(郭俊良，2020)。微生物学方面的研究重点在于探讨大熊猫发情期生殖道内微生物群落特性，进一步证实微生物会参与大熊猫发情期某些化合物的合成，并揭示了特定微生物群落在发情期雌性大熊猫化学通讯中的作用。但微生物学研究与大熊猫发情评估及排卵监测的关联度较低，不具备指导适时配种的能力。

6 光谱化学

Kinoshita等(2012)利用近红外光谱对3只发情周期个体进行相关分析，发现雌性发情状态与尿液中氢键水结构的增加有关；水带内的E1G标准浓度与雌激素水平有较高的相关性；在E1G峰值前后即排卵前后，尿样中强氢键水(S2、S3、S4)水平升高，弱氢键水(S0、S1)水平下降。近红外光谱可用于快速、无创地检测雌性发情程度。该检测方法或许开辟了一个新的监测领域，为大熊猫的发情配种提供了新的技术支持。但样品量少，未来需要进一步调查，以完善这一新方法。

7 其他方法学研究

Wallach等(1980)报道了6只大熊猫在发情时阴道黏液分泌量最多可达15 mL，pH5.5～6.5,同时黏液中NaCl含量会增加，从而引起电阻值的改变。李惠福等(1983)、朱本仁和陈远飞(1987)对 8只个体的11个发情周期进行研究，发现尿液中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在发情期的特异性变化与性行为高峰密切相关，且其第一峰与大部分雌性的行为高峰期吻合。侯蓉等(1998)发现4只正常发情大熊猫的阴道黏液电阻值会呈现出“V”形曲线，且其低谷值与尿液雌激素峰值对应，配种可控制在电阻值回升时进行。除此以外，刘玉良等(2009)在10只个体的 23个发情周期中发现，宫颈黏液(麻醉采集)结晶在发情前期呈水草状，排卵期(雌激素峰后0～1 d)呈典型的羊齿状，排卵后的第2天消失。宫颈黏液中呈现出典型的羊齿状结晶可能是判断雌性排卵的一个参考指标，而在雌性唾液里同样也发现了该现象(刘玉良等，2009；王无双等，2013)。但现有研究中的个体数偏少、研究深度不够、个体差异较大，甚至需要麻醉操作，宫颈黏液的生理学分析对大熊猫适时配种的应用有待进一步验证。在今后或许可以加强唾液生理学分析的深度与广度，以替代宫颈黏液用于发情鉴定与排卵监测。

除上述方法外，雌性大熊猫在发情期的基础体温(38.2～38.8 ℃)比正常体温(非发情期体温，36.5～37.5 ℃)高1 ℃以上，并在发情期前和发情后期出现低于正常体温的现象(陈玉村，陈玉华，1983；陈玉村等，1985)。邱贤猛(1987)发现发情期雌性阴道黏膜层组织切片比非发情期厚10～15倍。邱贤猛(1988)进一步发现，随着体内雌激素水平的升高，雌性大熊猫阴道复层扁平上皮的中层细胞大量增生，发情个体的阴道复层扁平(鳞状)上皮比非发情个体厚7～14倍。

综上所述，基础体温监测法与组织学分析仅能用于判断大熊猫是否处于发情期，而无法确定发情程度，更不能判断排卵时间，不足以指导大熊猫适时配种。发情期的体温监测在操作上也存在较大的难度。阴道活组织切片技术会对机体造成损伤，不提倡该方法的大量应用。

8 总结及讨论

国内外研究者在大熊猫发情配种及排卵监测上开展了大量的科学试验及应用实践工作，本文论述了正在使用的监测方法和评判标准。研究结果表明每种方法各有利弊，其指导实践的成效也各有不同。这种差异性归因于发情期及排卵期的生理反应在细胞、组织、器官及系统中的响应时间不同，以及各检测方法的灵敏度及准确性不同。

大量实践证实，行为和外阴观察法是判定大熊猫发情程度最易操作且直观的方法。但此方法易受观察者的经验及其他主观因素的影响，缺少稳定性。对于发情行为典型的雌性大熊猫，依靠这2种方法能较准确地判断和确定其配种时机。但对发情行为较隐蔽的个体，此方法的效能不足。除了行为观察法外，阴道上皮细胞角化率也是早期较常用的监测手段，但也存在个体差异性、发情高峰期样品不易收集、采样时会对雌性造成不同程度的外在刺激等问题，最终使得检测的准确性和时效性降低。若在没有其他监测手段(如激素监测)的情况下，阴道上皮细胞角化率监测仍是不错的选择，可以同时结合行为和外阴形态判断大熊猫的配种时机。

ELISA试剂盒的商业化及不断改进，可以有效地测定大熊猫尿液、粪便等非损伤性样品中的激素水平，从而避免麻醉、采血等应激刺激对大熊猫繁殖机能的不利影响。同时ELISA兼具实验条件简单、操作便捷、价格不高、检测时间较短(2～3 h)等特点。利用ELISA测定大熊猫雌激素水平在人工繁育中得到有效应用，目前雌激素监测被证明是确定自然交配或AI时间最准确的方法(彭世媛，叶志勇，1993；黄炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；杨胜林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；刘敏，2016；Wauters.，2018；沈洁娜等，2020)。

综合前人研究(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾国庆等，1990；李复东等，1993；彭世媛，叶志勇，1993；谢钟等，1994；Czekala.，2003；董武子，窦忠英，2003；Kersey.，2006；杨胜林等，2007；Huang.，2012a，2012b)，自然交配时间应控制在雌激素峰出现的当天或峰后1～3 d内；AI控制在雌激素峰后48 h内进行1次或2次。由于以上的大部分研究数据仅基于每日1次的采样频率，对于雌激素真实峰发生时间的判断会出现较大偏差，进而影响到配种时间的精准确定，导致分析结果差异。因此，为了确定尿液中雌激素真实峰的发生时间，应将尿液采集频率控制在3～6 h采样1次。结合雌激素与受孕率的关系(周杰珑等，2007；Huang.，2012a；侯蓉等，2012；Cai.，2017；沈洁娜等，2020)，自然交配控制在雌激素峰后36 h内进行1～2次；首次AI时间在雌激素峰后12 h内，12～24 h后进行第2次。若首次AI时间在峰后12～24 h，则6～12 h后进行第2次。

LH大量分泌标志着排卵即将发生，理论上LH峰出现时间是最适宜进行自然交配或AI。但由于大熊猫LH的ELISA试剂盒的商业化还在进行中，现阶段无法普及应用，数据量也还需进一步积累以进行更多的实践验证。而其他监测方法，如生化分析、微生物学分析、光谱化学分析、组织学分析、基础体温监测、宫颈黏液生理学分析等，由于研究关联度低、数据少、采样困难、费用较高、试验时间较长、方法不够成熟等，对大熊猫繁殖生产实践的指导意义不大，可作基础性研究。

综上所述，行为监测、外阴评估、雌激素监测和阴道细胞角化率是较有效的雌性大熊猫发情程度鉴定及排卵监测的方法，尤其是前三者更为常用。各繁育机构可根据自身实际条件选择其中一种或多种，建立切实有效的发情监测体系，比如：以雌激素为主，行为、外阴为辅的评估体系；或行为、外阴与阴道细胞角化率三者共同评估的体系。其他监测方法需进一步完善。

9 展望

在人类和其他哺乳动物上发现，发情期宫颈黏液中酶、蛋白质及碳水化物等物质均存在生理性的变化(王红等，1994；曹缵孙，1995；杜小丽，赵青云，1996)。根据宫颈黏液物理特性和化学组分随卵巢激素分泌变化而出现周期改变的特点，宫颈黏液评分应用于评价卵巢功能和预测排卵具有可行性(曹缵孙，1995)，因此未来大熊猫宫颈黏液评分的应用对发情鉴定、排卵判断和卵巢功能评估或许具有较为可行的参考价值。此外，可以利用影像技术(B超或腹腔镜)监测发情期大熊猫卵巢状态，找到卵泡发育与性激素水平的协同关系，以此推测排卵时间。从目前大熊猫发情鉴定和排卵监测方法的研究进展来看，生殖内分泌学和医学影像学是今后研究新监测方法的主要领域。