丙戊酸钠对严重烫伤合并海水浸泡损伤大鼠延迟补液时腹腔脏器功能和血流量的影响

孟祥熙，田雨沫，胡森，王莉莉，张慧苹，钟毓贤，王燕，王宏伟，孙奎，丁宇

1 承德医学院附属医院 烧伤整形科，河北承德 067000；2 解放军总医院医学创新研究部 创伤修复与组织再生研究中心，北京 100853；3 解放军总医院第六医学中心 康复医学科，北京 100048；4 承德医学院附属医院 病理科，河北承德 067000；5 解放军总医院第四医学中心 病理科，北京 100037；6 解放军总医院第六医学中心 骨伤科，北京 100048

我国海洋活动和海上军事活动日益频繁，海上船舶人员意外烧伤后不可避免合并有海水浸泡，海上环境特殊，有效救治常需要间隔一段时间，如果能实施有效的自救互救措施，维持身体内环境稳定，就能为后续系统治疗争取时间，提高救治成功率。以往研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有细胞保护、抗氧化、抗炎等作用[1-3]。丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在严重烫伤大鼠模型中，丙戊酸钠能改善心脏、肺、肠道等重要脏器功能，延长存活时间[4-6]。严重烧伤后合并海水浸泡，因海水低温、高渗透压、细菌含量高等特点，救治难度更大[7]。以往这方面研究较少，因此本实验模拟大鼠严重烫伤后合并海水浸泡，伤后立即给予抗休克维持药物丙戊酸钠，观察其较单纯延迟补液复苏对脏器功能和生存率的影响。

材料与方法

1 实验动物 180 只清洁级雄性SD 大鼠，60～70 d 龄，体质量250～ 300 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2019-0010。购进后适应性饲养1 周以上，室温维持在22℃～25℃，自由饮食。实验前12 h 禁食、自由饮水。本研究经解放军总医院实验动物伦理委员会批准。

2 主要仪器和试剂 丙戊酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；戊巴比妥钠(SIGMA 公司)；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO) ELISA 检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。DI PowerLab 多导生理记录仪(澳大利亚ADInstruments)；RAPIDPoint500 血气分析仪(德国西门子公司)；CKX53 型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；科华ST360 酶标仪(上海科华生物工程股份有限公司)；激光多普勒血流仪(瑞典PERIMED 公司)。

3 人工海水配置 实验用人工海水按照国家海洋局第三海洋研究所提供海水主要成分配制(盐度2.54%，渗透压1 250～ l 350 mmol/L，pH 8.2)。实验时人工海水的温度为(23±1)℃。

4 动物模型制备和分组 大鼠按照随机数字表法分为单纯烫伤+延迟补液组(S 组)、烫伤+海水浸泡+延迟补液组(SS 组)、烫伤+海水浸泡+VPA +延迟补液组(SSV 组)，每组60 只。术前禁食12 h、自由饮水，动物称重后给予戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，固定、消毒、解剖分离一侧颈总动脉、静脉，分别插管，剪除颈背部和臀部的毛发，浸泡于100℃沸水中15 s 造成35% 总体表面积Ⅲ度烫伤(烫伤深度经病理组织切片检查证实)，SS 组和SSV 组伤后立即浸泡于人工海水中(23℃，30 min)。SSV 组出水后即刻皮下注射VPA(300 mg/kg)。各组伤后2 h 按1/2 Parkland 公式静脉输入乳酸钠林格注射液(30 min 完成)。

5 生存率观察 每组取20 只大鼠，观察24 h，记录动物死亡时间，计算各组大鼠生存率。

6 相关指标及病理检测 各组于伤前、海水浸泡后即刻、海水浸泡后2 h、海水浸泡后5 h 选取10 只大鼠，采用ADI PowerLab 多导生理记录仪测定平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，数字测温仪插入肛门10 cm 处，测定直肠温度(rectal temperature，RT)，血气分析仪测定血乳酸(lactic acid，Lac)，Elisa 法测定丙氨酸氨基转移酶、肌酐、二胺氧化酶含量，激光多普勒血流仪检测肝、肾、小肠黏膜血流量，取肝、肾、小肠组织，HE 染色后，显微镜(400×)下观察和拍照。

7 统计学处理 SPSS19.0 统计软件处理数据，检测各项指标所得的结果均以表示，多组间比较采用单因素方差分析和两独立样本t检验，采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组生存率比较 S组伤后24 h 存活数为18 例(18/20)，累计生存率为90%。SS 组大鼠存活数为11 例(11/20)，累计生存率为55%，较S 组明显降低(χ2=6.6，P＜0.05)。给予VAP 治疗后，SSV组存活数为15 例(15/20)，累计生存率为75%，较SS 组明显提高(χ2=4.3，P＜0.05)。见图1。

图1 Kaplan-Meier 生存曲线Fig.1 Kaplan-Meier survival curve

2 各组MAP 和RT 变化 与S 组比较，SS 组和SSV 组伤后0 h、2 h、5 h MAP、RT 明显降低(P均＜0.05)。与SS 组比较，SSV 组MAP、RT在伤后2 h、5 h 较SS 组明显升高(P均＜0.05)。见图2。

图2 丙戊酸钠对MAP(A)、RT(B) 的影响(a P＜0.05,vs S 组;bP＜0.05,vs SS 组)Fig.2 Effect of valproic acid on mean arterial pressure (A) and rectal temperature (B) (aP＜0.05,vs group S;b P＜0.05, vs group SS)

3 各组Lac 水平变化 与S 组比较，SS 组伤后0 h、2 h、5 h Lac 水平明显升高(P均＜0.05)。给予VPA 治疗后，在伤后2 h、5 h SSV 组Lac 水平明显降低，与SS 组比较均有统计学差异(P均＜0.05)。见图3。

图3 丙戊酸钠对血乳酸(Lac)的影响(aP＜0.05,vs S 组;bP＜0.05,vs SS 组)Fig.3 Effect of valproic acid on lactic acid (Lac) (aP＜0.05,vs group S;bP＜0.05,vs group SS)

4 各组肝、肾、小肠黏膜血流量变化 与S 组比较，在伤后0 h、2 h、5 h，SS 组和SSV 组肝、肾、小肠黏膜血流量明显降低(P均＜0.05)。与SS 组比较，SSV 组在伤后2 h、5 h 肝、肾、小肠黏膜血流量明显升高(P均＜0.05)。见图4。

图4 丙戊酸钠对肝(A)、肾(B)、小肠黏膜(C)血流量的影响(aP＜0.05,vs S 组;bP＜0.05,vs SS 组)Fig.4 Effect of valproic acid on blood flow of liver (A),kidney (B),intestinal (C) (aP＜0.05,vs group S;bP＜0.05,vs group SS)

5 各组血浆内ALT、Cr、DAO 水平变化 SS 组和SSV 组在伤后0 h、2 h、5 h 的ALT、Cr、DAO水平较S 组均明显升高(P均＜0.05)。给予VPA处理后，SSV 组ALT、Cr、DAO 水平较SS 组均明显降低(P均＜0.05)。见图5。

图5 丙戊酸钠对ALT(A)、Cr(B)、DAO(C)的影响(aP＜0.05,vs S 组;bP＜0.05,vs SS 组)Fig.5 Effect of valproic acid on alanine aminotransferase (A),creatinine (B),diamine oxidase (C) (aP＜0.05,vs group S;b P＜0.05,vs group SS)

6 各组肝、肾、小肠病理变化 各组大鼠于伤前和伤后即刻肝、肾、小肠组织结构完整，细胞排列整齐、紧密，在伤后2 h，各脏器组织细胞出现水肿、细胞间隙增宽，随伤后时间延长，组织损伤程度逐渐加重。伤后2 h、5 h，SS 组各脏器组织水肿和损伤情况较S 组明显加重。给予VPA 治疗后，SSV 组组织损伤情况较SS 组明显缓解。见图6、图7、图8。

图6 大鼠肝组织病理变化(HE 染色，400×)Fig.6 Pathomorphological observation of liver tissues of the rats (HE staining,400×)

图7 大鼠肾病理变化(HE 染色，400×)Fig.7 Pathomorphological observation of kidney tissues of the rats (HE staining,400×)

图8 大鼠小肠组织病理变化(HE 染色，400×)Fig.8 Pathomorphological observation of small intestine tissues of the rats (HE staining,400×)

讨 论

严重烧伤后，皮肤屏障受损，毛细血管通透性增加，组织液大量渗出，有效循环血量锐减，引起低血容量性休克，组织灌注不足，同时伴有乳酸堆积、全身炎症反应加重和氧自由基损伤[8-9]。烧伤后创面海水浸泡，进一步加剧创面浆液性渗出，导致血流动力学紊乱，加重缺血缺氧性损伤和酸碱失衡，较单纯烧伤对机体损伤更重，救治难度更大[10-12]。若伤后即刻或早期皮下注射丙戊酸钠，可提高机体对休克的耐受能力，对后续治疗意义重大。

组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶在生理状态下保持高度平衡，当机体在创伤、缺血缺氧的情况下，这种平衡被打破，组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过抑制去乙酰化酶活性维持“乙酰化动态平衡”，保护细胞功能[13]。丙戊酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在烧伤、脓毒症和休克动物模型中，丙戊酸钠能降低血管通透性，改善能量代谢，抑制炎症反应，减轻脏器水肿[14-16]。本实验建立35% TBSAⅢ°烫伤合并海水浸泡延迟补液大鼠模型，观察丙戊酸钠对血乳酸、腹腔脏器血流量及功能、生存率的影响。本实验中S 组24 h 生存率为90%，SS 组生存率为55%，表明烫伤后海水浸泡较单纯烫伤生存率明显降低，给予VPA 治疗后，24 h 生存率可提高至75%，较SS组明显升高。

严重烧伤后创面大量浆液性渗出，引起组织和器官灌注不足，细胞缺血缺氧，乳酸代谢紊乱，血乳酸水平升高，导致高乳酸血症，成为导致多器官功能障碍综合征的重要因素[17]。因此乳酸水平可作为反映机体组织灌注不足、组织器官缺血缺氧的重要监测指标[18]。通过监测发病早期血乳酸水平计算乳酸清除率，不仅能监测早期组织灌注和细胞代谢情况，而且与预后直接相关[19]。单纯海水浸泡后，引起机体低体温、高渗性脱水、血流动力学紊乱、凝血功能障碍等损伤[11,20]。本实验研究发现，与S 组比较，SS 组伤后0 h、2 h、5 h 的MAP、RT 明显降低，Lac 水平明显升高，表明烫伤后创面海水浸泡较单纯烫伤大鼠血流动力学更加不稳定，组织灌注和缺血缺氧更加严重。给予VPA 治疗后，与SS 组比较，SSV 组MAP、RT 明显升高，Lac 水平明显降低，证实VPA 在严重烧伤合并海水浸泡的大鼠延迟补液中，能维持有效循环，改善组织灌注和缺血缺氧性损伤，保护组织细胞的正常代谢。

脏器血流量反映脏器灌注情况，Cr、ALT、DAO 是反映肝、肾、肠道功能的重要指标，同时反映脏器功能的损伤程度。各组大鼠在伤后肝、肾和肠道血流量明显降低，Cr、ALT、DAO 明显升高，与单纯烫伤组比较，SS 组脏器血流量下降水平明显降低，Cr、ALT、DAO 水平明显升高，表明伤后创面海水浸泡加重腹腔脏器灌注减少和脏器功能的损伤。而SSV 组在伤后2 h、5 h 较SS 组均脏器血流量明显提升，Cr、ALT、DAO 水平明显降低，表明VPA 能改善腹腔脏器血流量和腹腔脏器功能。在严重烫伤合并海水浸泡延迟复苏治疗中，伤后即刻给予丙戊酸钠治疗，可提高腹腔脏器血流灌注，保护腹腔脏器功能，增加机体对低血容量休克的耐受能力。

综上所述，本实验通过观察丙戊酸钠对35%TBSAIII°烫伤大鼠合并海水浸泡后延迟补液时血乳酸、腹腔脏器血流量和脏器功能的影响，证实丙戊酸钠可改善腹腔脏器血流量和脏器功能，维持血流动力学稳定，提高生存率，但具体机制有待进一步研究。