去除尼古丁和焦油的香烟烟雾提取物对大鼠阴茎平滑肌Cx43 表达及勃起功能的影响

郑 红 吴天鹏 王 莹 刘凌琪 杨嗣星

武汉大学人民医院泌尿外科Ⅱ科 湖北 武汉 430060

在阴茎的勃起过程中，动脉平滑肌和海绵体平滑肌在勃起过程中起到关键作用，性刺激会触发阴茎海绵体末梢的神经递质释放，进而使平滑肌舒张，血管内血流无论在收缩期或者舒张期都会处在一个扩张状态［1，2］。缝隙连接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx43 是构成血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的主要缝隙连接蛋白，在大多数大中动脉的中层平滑肌主要表达 Cx43［3，4］。本文旨在探讨去除尼古丁和焦油的香烟烟雾提取物（nicotine‑ and tar‑free cigarette smoke extract,fCSE）对雄性大鼠阴茎平滑肌Cx43 表达及对勃起功能影响的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料挑选8 周龄SD 雄性健康大鼠30 只，无特定病原体（SPF）级，体质量（239.53±12.29）g。鼠抗Cx43 单克隆抗体为美国Zymed 公司产品。使用Bio‑Rad 公司软件系统控制的共聚焦系统，在Pentium 90 计算机运行。

1.2 fCSE 的制备参照 Shimosato 等［5］方法，经负压吸引器对燃烧的香烟（焦油含量9 mg，尼古丁含量0.6 mg）进行连续抽吸，吸至磷酸盐缓冲液（PBS）中形成悬液（3 支/mL，即每毫升中有 3 支香烟的量），烟雾滤过剑桥玻璃滤片吸至PBS，悬液用1 mmol/L 的 NaOH 调节到 pH 7.0，经直径 0.22 μm微孔过滤膜除菌过滤为fCSE 原液，每次提取液均经过紫外分光光度计校准。

1.3 分组将30 只大鼠分为对照组、fCSE 组、fC‑SE+还原型谷胱甘肽（GSH）组（即抗氧化组）各10只，对照组每天于300 g 体质量皮下注射PBS 1.0 mL，fCSE 组每天于皮下注射fCSE 注射液1.0 mL，两组肌肉注射同样体积的生理盐水200 mg/kg；fC‑SE+GSH 组每天于皮下注射fCSE 1.0 mL，后肌肉注 射 GSH 200 mg/kg；3 组 实 验 于 1 min 内 注 射 完成，并持续8 周。

1.4 勃起功能测定8 周后将脱水吗啡（APO）按100 g/kg 比例皮下注射于大鼠颈部皮肤松软处，观察大鼠阴茎勃起情况，统计发生勃起的大鼠比例及大鼠勃起的次数，在大鼠颈部皮肤松软处按100 g/kg 的剂量皮下注射APO 溶液。密切观察30 min，详细记录大鼠阴茎勃起的次数，大鼠阴茎勃起的标准：包皮后退，龟头露出并充血，阴茎膨大增长。

1.5 取材8 周后用1%的戊巴比妥按50 mg/kg剂量经腹腔注射麻醉后固定于鼠台上，延下腹部切口至阴囊纵隔，将阴茎充分游离后，钝性分离阴茎根部，暴露出阴茎脚。取一小段阴茎海绵体组织至于4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定过夜，常规石蜡包埋、切片。

1.6 光镜观察各选取一段阴茎海绵组织于光镜下观察阴茎海绵体平滑肌肌纤维结构、对比结缔组织、胞质、细胞核、血窦的变化。

1.7 间接免疫荧光标记二甲苯脱蜡，依次经100%、75%梯度乙醇溶液脱水，加入3%H2O2灭活内源性过氧化物酶30 min，经双蒸馏水振洗，分别加鼠抗 Cx43 单克隆抗体（1∶500），湿盒内 37 ℃孵育 1 h，PBS 振洗 10 min×3 次［6］。

1.8 激光共聚焦扫描显微镜观察依据样本的不同在共聚焦系统提供的梯级值内选择扫描所用的激发值，使用Bio‑Rad 公司软件系统控制的共聚焦系统，在Pentium 90 计算机运行。以胞质中和/或胞膜上出现绿色荧光信号为阳性，根据阳性细胞所占视野面积的百分比观察对照组、fCSE 组、fCSE+GSH 组 Cx43 密度情况 。

1.9 统计学方法数据以均数±标准差（）表示，多组间计量资料比较用单因素方差分析（ANO‑VA），分类资料的比较采用卡方检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴茎勃起次数和勃起率见表1。fCSE 组与对照组相比，fCSE 组的大鼠勃起率仅有20%，勃起率和勃起次数均较对照组也有显著下降（P<0.01），而对照组与fCSE+GSH 组无显著性差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠注射APO 后阴茎勃起次数和勃起率与阴茎海绵体平滑肌Cx43 的表达

2.2 病理学改变对照组海绵体平滑肌肌纤维排列致密，纤维结缔组织少，胞质嗜酸性，细胞核椭圆形或长杆状，血窦扩张、充血。fCSE 组平滑肌排列稍紊乱，血窦扩张，但未充血，纤维结缔组织较多。fCSE+GSH 组与对照组相似（见图1）。

图1 大鼠阴茎海绵体海绵体平滑肌病理照片（HE×400）

2.3 Cx43 密度值的测定见表1。对照组和fC‑SE+GSH 组Cx43 密度之间无统计学差异；但fCSE组Cx43 密度与对照组和fCSE+GSH 组差异显著。

2.4 Cx43 荧光信号的分布对照组和fCSE+GSH 组大鼠阴茎海绵体平滑肌Cx43 阳性信号强烈，荧光信号分布于细胞的胞质中和/或胞膜上（图2），fCSE 组Cx43 阳性反应的范围及强度均明显减弱，呈散在分布的点状绿色弱荧光信号。fCSE 组Cx43 的密度明显较对照组和fCSE+GSH 组下降。

图2 激光共聚焦扫描显微镜下阴茎海绵体平滑肌Cx43 的图像表达（荧光标记×200）

3 讨论

基础和临床的研究证明，吸烟可导致勃起功能下降，而香烟中尼古丁被作为引起勃起功能下降的重要因素之一［7］。细胞培养研究也发现［8］，尼古丁可诱导NADPH 氧化酶（NOX）产生活性氧（ROS），进而影响到阴茎海绵体血管平滑肌细胞Ⅴ型磷酸二酯酶（PDE‑5）的表达，使得勃起反应下降。但香烟烟雾成分复杂，其可分为气相及固相物质（能被剑桥滤片滤过的烟雾称为气相物质，而被截流下的部分为固相物质）。本次研究主要是观察去除尼古丁和焦油的香烟烟雾提取物（fCSE）的原液对大鼠勃起功能及阴茎平滑肌Cx43 密度的影响。

缝隙连接是细胞之间进行信息交流的重要通道，而连接蛋白的磷酸化修饰作用是其重要的一环。多项研究认为，缝隙连接在阴茎勃起中起到重要作用，其可能与协调平滑肌舒张功能有关。与其他连接蛋白相比，Cx43 的分布更为普遍，Cx43 通道对细胞间信号具有更大的通透性。Cx43 是一种动态的蛋白质，与如此多不同的蛋白质相互作用是调节Cx43 生命周期的每一步所必需的：形成、向前传输到质膜上正确的子域、组装在质膜上、逆行贩运和降解。迄今为止，已发现连接蛋白的21 种亚型；它们以不同的调控和通透性在人体所有器官和组织中表达。Cx43 并不单独发挥作用，而是与来自同一基因和mRNA 的其他蛋白质和较小的亚型一起作用［9］。这些特性决定了Cx43 在调节细胞生命活动中起着更重要的作用［9］。有研究显示，弹性大动脉的平滑肌细胞中Cx43 表达非常丰富，Cx43 蛋白发生磷酸化作用，并从内质网和高尔基体迁移至细胞膜组成缝隙连接通道［10，11］，其参与协调平滑肌细胞的迁移、增殖和表型转换等过程。

前期研究发现，fCSE 对阴茎勃起功能的下降与氧化应激损伤相关，一方面，尼古丁可通过提高血管平滑肌细胞PDE‑5 的活性，使NO 产生下降，改变了平滑肌的张力，导致了勃起功能障碍（ED）的产生；另一方面，尼古丁可增加血管和海绵窦平滑肌细胞中NOX 的表达，上调了NOS 的活性，从而影响到了NO 的利用度［12］。在激光共聚焦扫描显微镜下发现，阴茎海绵体标本Cx43 密度下降，提示ED 发生除上述的机制外，同时可能和缝隙连接及Cx43 异常表达有关。本次fCSE 组大鼠阴茎平滑肌排列稍紊乱，血窦扩张，但未充血，纤维结缔组织较多，平滑肌发生组织重构的结论得到证实。

目前Cx43 参与调节阴茎平滑肌的功能的机制不明，考虑可能是利用Cx43 构成的缝隙连接将功能状态的变化以各种信号方式传递到相邻细胞，诱导相邻细胞的激活，从而促进细胞的增殖和迁移。本次实验中fCSE 组与fCSE+GSH 组及对照组密度差异显著，原因可能为一方面fCSE 可能导致了Cx43 蛋白氧化应激损伤，进而其密度出现下降，影响细胞增殖和重构的进程；另一方面，钙作为一种重要的第二信使，可促进血管平滑肌的收缩、增殖和迁移，Cx43 密度的下降可影响细胞外钙转入细胞内的浓度下降，进而影响平滑肌的增殖和迁移［4］。

ROS 作为一种强烈的氧化应激信号，不仅能直接损伤细胞或组织，而且能间接激活一系列损伤相关的信号通路。fCSE+GSH 组经GSH 治疗后，无论大鼠的勃起次数和勃起频率还是光镜及共聚焦显微镜下组织均较fCSE 组有所改善，与对照组实验结果相一致，说明抗氧化治疗能够明显改善香烟烟雾中ROS 对勃起功能的影响。但还原谷胱甘肽抗氧化治疗过程中是否对Cx43 通道信号传递造成影响尚不清楚。ROS，包括氧自由基和非自由基化合物，是少数可以通过Cx43 通道传递的信号之一，Cx43 通道介导了ROS 在邻近细胞间的持续扩散，但其调控机制是正向还是负向存在争议。一项关于肠损伤的研究发现，Cx43 通道功能的改变调节了邻近细胞间ROS 的转移，从而介导了Sirt1（沉默信息调节因子 2 相关酶 1）/FoxO3a（叉头蛋白 O3a）信号通路的激活，进而造成肠道细胞或组织损伤［13］。

Cx43 在参与平滑肌的功能及血管的重构过程中有重要意义，但相关研究发现其具有双向调节作用，也有研究发现Cx43 密度减少反而能促进平滑肌细胞增殖，其具体机制尚需进一步研究。利用相关药物或者靶向治疗调控Cx43 的表达，改善患者平滑肌细胞的病理性重构或者增殖，能为后期临床诊疗提供有一定价值的探索。