不同化学诱变剂对苎麻种子萌发的影响

蒋榕，赵亿嘉#，袁林，曾俊普，邢虎成，2，3，4*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学苎麻研究所，湖南 长沙 410128；3.湖南省种质资源创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128；4.湖南省草类作物种质创新与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudich)起源于中国，又称“中国草”[1]，主要用于生产纤维，其纤维可做纺织工业的原料[2]。苎麻是我国第二大纤维作物，产量约占全世界总产量的96%，仅次于棉花[3]。

近年来，我国培育出一批高产优质新品种，如“湘饲纤兼用苎1号”平均纤维产量可达2559.45 kg/hm2，纤维支数可达2300支/hm2[4]，纤维品质大幅提高，这表明苎麻产量和品质遗传改良的潜力很大。目前我国苎麻育种方法和手段单一，育种周期长、效率低，盲目性较大[5]，因此，改善苎麻育种方法以获得高产优质苎麻品种的任务十分迫切而艰巨。

诱变育种解决了传统遗传育种的瓶颈，增强了遗传多样性[7]。近年来，诱变育种在苎麻育种中取得较大成绩，目前用于苎麻诱变育种的方法有物理诱变、化学诱变和太空诱变[8-9]。湖南农业大学苎麻研究所历经20年，使用秋水仙碱进行诱变选育出的苎麻多倍体新品种Tri-1、Tri-2，于2001年通过湖南省种子管理站专家现场评议，2003年通过湖南省品种登记并公布[10]。潘昌立等[11]以0.10%～0.40%秋水仙素水溶液处理子叶期实生苗茎尖，平均诱导率达到了9.04%。但目前未见使用甲基磺酸乙酯(EMS)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、氨磺灵(Oryzalin)、马来酰肼(MH)对苎麻种子进行诱变的报道。本试验基于前人对化学诱变育种的研究，采用不同浓度的EMS、5-BU、Oryzalin、MH对苎麻种子进行不定向诱导，研究其对种子萌发的影响，探究最佳处理时间与诱变剂量组合，旨在为后续使用化学诱变剂进行苎麻种子诱变研究提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料:湘苎三号苎麻种子，由湖南农业大学苎麻研究所提供。

化学诱变剂:甲基磺酸乙酯(EMS)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、氨磺灵(Oryzalin)、马来酰肼(MH)均购买自sigma-aldrich公司。

1.2 试验方法

选取质量均匀一致的种子，采用蒸馏水浸种2 h后再进行化学药剂浸泡处理。EMS处理体积百分浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.2%，5-BU处理质量百分浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，Oryzalin处理质量浓度为20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L，MH处理质量百分浓度为 0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%、0.18%，处理时间为2、24、48 h，每处理 3次重复，每重复 300粒苎麻种子。处理结束后，用蒸馏水洗涤3次，将种子平铺于放有滤纸的培养皿中，放置在培养室中培养，保持种子湿润。

1.3 数据统计与处理

以胚根露出种皮为萌发标准。统计发芽势(第12天)、发芽率(第20天)。

相对发芽势(%)=处理的发芽势/对照发芽势×100%

相对发芽率(%)=处理的发芽率/对照的发芽率×100%

相对致死率(%)=(1-处理的发芽率/对照的发芽率)×100%

诱变剂的半致死浓度(LCt50)是指在一定时间内引起50%植株死亡的药物浓度，本试验以苎麻种子相对发芽率为指标计算相对致死率，以此作为诱变剂的半致死浓度和处理时间，试验数据采用Excel和DPS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 EMS不同处理对种子萌发的影响

从表1可看出，EMS处理后的苎麻种子萌发情况依处理时间与处理浓度的变化而变化。在相同处理时间内，随着处理浓度的增加相对发芽率呈下降趋势；在浓度为0.8%与1.0%时，随着处理时间的增加，相对发芽率整体呈下降趋势。在处理时间为2 h与48 h时，各浓度EMS处理苎麻种子的萌发均受到抑制；而在24 h处理后，浓度为0.1%、0.2%和0.4%的EMS处理组的发芽势与发芽率均有提高，说明在24 h处理下，较低浓度的EMS处理可提高苎麻种子发芽势与发芽率。处理48 h后，0.8%和1.0%处理浓度对苎麻种子萌发完全抑制，说明在较高浓度EMS较长时间处理后，苎麻种子的萌发受到严重影响，甚至导致种子死亡。1.0%EMS处理苎麻种子2 h，相对致死率为51.60%；0.8%EMS处理苎麻种子24 h，相对致死率为57.89%；0.4%EMS处理苎麻种子48 h，相对致死率为40.98%。这3个处理的半致死剂量都接近50%，试验中可根据要求进行自由选择，本试验结果推荐采用1.0%EMS处理苎麻种子2 h为最佳处理组合。

表1 EMS处理对苎麻种子发芽的影响Table 1 Effects of EMS on seed germination of ramie

2.2 5-BU不同处理对种子萌发的影响

从表2可看出，5-BU处理对苎麻种子的萌发起到抑制作用。在相同处理时间内，随着处理浓度的增加相对发芽率下降；在处理浓度为1.5%和2.0%时，相对发芽势随处理时间的增加先增加后减少。5-BU处理浓度为1.5%和2.0%时，48 h处理组相对发芽率较24 h处理组低，但高于2 h处理组。48 h与2.5%浓度处理组中种子的萌发完全受到抑制。说明在较低浓度(1.0%)或较短处理时间(24 h)内，5-BU对苎麻种子萌发的抑制作用随着处理时间的延长而逐渐减小，而较高浓度或较长时间处理后，该现象逐渐消失。2.5%5-BU处理2 h的相对致死率为44.55%，可推荐为最佳处理组合。

表2 5-BU处理对苎麻种子发芽的影响Table 2 Effects of 5-BU on seed germination of ramie

2.3 Oryzalin不同处理对种子萌发的影响

由表3可看出，Oryzalin处理可以抑制苎麻种子萌发。相同处理时间内，种子相对发芽率随着处理浓度增加而下降；相同处理浓度下，种子相对发芽率同样随着处理时间增加而下降。说明Oryzalin对苎麻种子萌发的抑制作用随着处理浓度的增大和处理时间的延长而增大，并在处理时间为48 h、处理浓度为25 mg/L和30 mg/L时完全抑制种子萌发。25 mg/L的Oryzalin与24 h处理组合相对致死率为52.05%，可推荐为最佳处理组合。

表3 Oryzalin处理对苎麻种子发芽的影响Table 3 Effects of Oryzalin on seed germination of ramie

2.4 MH不同处理对种子萌发的影响

由表4可知，MH可以影响苎麻种子的发芽率。在处理浓度为24 h与48 h时，相同处理时间内，随着处理浓度的增加相对发芽率下降；在相同浓度处理下，随着处理时间的延长发芽率下降。MH浓度在0.03%～0.06%时，2 h和48 h处理的苎麻种子相对发芽率随浓度的增加而增加；当MH浓度在0.12%～0.18%时，24 h和48 h处理的苎麻种子相对发芽率随浓度的增加而减少。而MH 24 h处理中，苎麻种子相对发芽率会随MH浓度的增加而减少。综合考虑，采用MH进行苎麻种子诱变，需要采用较高药剂浓度和较长处理时间才能达到半致死剂量。本试验结果表明，0.12%MH处理48 h的相对致死率为50.82%，可推荐为最佳处理组合。

表4 MH处理对苎麻种子发芽的影响Table 4 Effects of maleic hydrazide on seed germination of ramie

3 讨论

化学药剂诱导植物基因突变是开发新种质的有效途径之一，为获得理想诱变结果，确定适宜的诱变剂量十分必要。本试验探究4种化学诱变剂对苎麻种子萌发的影响，以寻找这4种诱变剂最佳处理时间与处理浓度组合。由于苎麻种子本身发芽率并不高，为使数据更直观明了，本试验采用分析其相对发芽势、相对发芽率以及相对致死率的方法。

EMS是一种常用的烷化剂，在作物诱变育种中有着积极作用[12]，可通过烷化鸟嘌呤而改变DNA结构[13]。本试验结果表明，EMS处理2 h和48 h后的苎麻种子发芽率均低于对照组，且发芽率随着处理浓度的增加而下降，苎麻种子萌发受到了显著的抑制作用。吴思远等[14]的研究同样表明，EMS对种子萌发的抑制作用随着浓度的增加而增大，但在处理时间为24 h的处理中，处理体积百分浓度为0.10%～0.40%时，对种子的萌发有着不同程度的促进作用。秦思思等[15]的研究表明，体积百分浓度为0.4%的EMS浸种16 h和24 h对醉鱼草种子的萌发有促进作用。相关研究[16]表明，很多基因都参与植物种子萌发的调控，EMS诱变可能会对这些基因产生影响，从而激发抑制种子萌发的基因或改变种子萌发基因的表达。1.0%体积百分浓度的EMS处理2 h的相对致死率为51.60%，最接近半致死，推荐1.0%EMS处理2 h为最优半致死剂量和处理时间。

5-BU是碱基类似物类型的化学诱变剂。Kiichi等[17]用BU在25°C时的饱和溶液和半饱和溶液处理水稻品种“Ginbozu”的风干种子，所有处理的平均种子育性都低于对照，BU处理的平均育性最低为75.6%，比对照低8.2%，M2植株抽穗期的诱变频率为0.67%～4.87%，说明BU处理后诱发水稻农艺性状变异的频率相当高。本研究中5-BU各处理时间与浓度处理组的苎麻种子发芽势和发芽率均有下降，苎麻种子的萌发受到明显抑制。在2.5%质量百分浓度处理48 h后苎麻种子完全丧失发芽能力。郑改笑等[18]的研究表明，5-BU诱变使寒兰再生株的部分基因组扩增条带缺失，碱基类似物5-BU可能导致苎麻种子的部分基因片段被改变，从而对种子萌发造成不利影响，2.5%质量百分浓度5-BU处理2 h的组合相对致死率为44.55%，是最接近半致死的处理组合，虽然在48 h处理下，2.0%～2.5%质量百分浓度的5-BU也可找到半致死剂量，但在浓度相差不大的情况下，2 h处理时间较短，所以推荐2.5%5-BU处理2 h为最优半致死剂量和处理时间。

Oryzalin可使植物染色体加倍[19]，低毒且具有良好的多倍体诱变效果[20]。陈娟娟[21]用0.05 g/L Oryzalin处理郁金香种子10 d，相对萌发率为40%，在相同浓度下，随着处理时间增加，萌发率下降，在相同处理时间，药剂浓度增加萌发率下降。这与本研究结果相近。本研究中Oryzalin处理苎麻种子可以显著抑制其萌发。Oryzalin处理浓度一定时，处理时间延长则抑制作用增强；处理时间一定时，药剂处理浓度增大则抑制作用增强。张竞秋等[21]用Oryzalin处理小麦种子，观察到小麦根尖细胞出现染色体加倍和不均等分裂、桥等染色体畸变现象，推测Oryzalin导致的染色体变异可加速细胞凋亡，25 mg/L的Oryzalin处理24 h组合的相对致死率为52.05%，最接近半致死，推荐其为最优半致死剂量和处理时间。

MH是一种抗生长素类的生物调节剂[23]，可延长种子休眠期、抑制发芽等[23]。刘海英等[26]的研究表明，MH提高了小麦相对雄性不育率，且随处理浓度升高效应增强。本研究中，0.06%～0.18%质量百分浓度MH处理苎麻种子24 h和48 h后，种子萌发均受到抑制，随着处理浓度的升高抑制作用增强。MH对植物的核酸和蛋白质的代谢过程可造成干扰[23]，在本研究中MH可能对苎麻种子萌发过程中所需要的蛋白质合成产生抑制作用，从而影响种子的萌发。0.12%质量百分浓度MH处理48 h后相对致死率为50.28%，最接近半致死，推荐其为最优半致死剂量和处理时间。

4 结论

本试验探究了EMS、5-BU、Oryzalin和MH对种子萌发影响的规律，初步筛选出较合适的半致死浓度和处理时间，1.0%EMS处理苎麻种子2 h，2.5%5-BU处理2 h，25 mg/L Oryzalin处理24 h，0.12%MH处理48 h，是4种药剂的最佳处理组合。本研究为苎麻化学诱变育种提供了最佳的诱变条件，即半致死浓度和处理时间，这为进一步采用化学诱变育种提供了基础，为种质资源创新、创建新性状和新基因提供了条件，也为饱和基因库构建、基因功能分析、基因定位等提供了条件。