基于近、中红外光谱的热毒宁注射液制剂过程投料和二次热处理工序快速检测方法研究

童 枫，徐芳芳，张 欣，李执栋，吴 云，章晨峰，王振中

基于近、中红外光谱的热毒宁注射液制剂过程投料和二次热处理工序快速检测方法研究

童 枫1，徐芳芳2, 3*，张 欣2, 3，李执栋2, 3，吴 云2, 3，章晨峰2, 3，王振中2, 3*

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023 2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001 3. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001

应用近红外光谱（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）与中红外光谱（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技术，对热毒宁注射液（Reduning Injection，RI）制剂过程的投料和二次热处理工序中6种质控指标进行快速检测，提高制剂过程的质量控制水平。利用NIRS透射技术与MIRS衰减全反射技术，结合偏最小二乘法（partial least squares，PLS），经过光谱预处理方法的优选以及波段筛选，分别建立绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的快速预测模型，以校正集相关系数（cal）、验证集相关系数（pre）、校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）、预测相对误差（relative standard error of prediction，RSEP）为评价指标，评价模型性能。NIRS预测模型的6个质控指标的RMSEC和RMSECV均小于0.3，RSEP小于4.0%；MIRS预测模型的6个质控指标的RMSEC和RMSECV均小于0.4，RSEP均小于5.0%，建立的PLS模型具有模型性能好、预测精度高的优点。NIRS及MIRS分析技术，均可用于RI投料和二次热处理工序中6种质控指标的快速检测，模型RSEP在5%以内，方法操作简单，结果可靠。

近红外光谱；中红外光谱；热毒宁注射液；制剂过程；光谱预处理；波段筛选；偏最小二乘法；绿原酸；新绿原酸；隐绿原酸；栀子苷；断氧化马钱子苷；固含量

热毒宁注射液（Reduning Injection，RI）是江苏康缘药业股份有限公司的独家品种，由青蒿、金银花、栀子3味药材制得，具有清热、疏风、解毒的功效，常用于上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、痰黄等症状及抑制流感病毒[1-2]。在中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第九版）》中，针对重型、危重型新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者推荐的中成药中，RI也名列其中[3]。

RI的生产过程可以分为提取、精制和制剂过程，目前，利用近红外光谱（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）或中红外光谱（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技术结合化学计量学，针对RI提取、精制过程的快速检测已较为成熟，并取得一定的应用效果[4-8]。但是，基于NIRS和MIRS的RI制剂过程的快速检测研究尚未见报道。因此，基于RI的制剂过程，研究合适的快速检测方法，可为RI制剂过程的质量控制水平的提升提供技术支撑。NIRS以及MIRS作为过程分析技术的典型代表，近年来发展迅速。与传统的化学分析方法相比，这2种光谱分析方法具有以下优点：（1）可同时用于定性和定量分析；（2）分析速度快，只需扫描得出光谱即可测定样品中的各种成分；（3）不使用化学试剂，不损害样品，对环境友好；（4）分析成本低，操作简单[9-11]。

投料和二次热处理工序指的是投料和二次热处理2个连续工序，即在一定的温湿度以及压力下，依次将栀子提取物以及青金提取物投入到合并一定比例的注射用水和盐酸的配液罐中，待冷却后转移至冷藏罐；冷藏罐内药液通过板框过滤器滤过至热配间热配罐中，调节蒸气压力以及药液温度，一段时间后对药液进行冷却。

投料和二次热处理工序作为RI制剂过程的初始工序，在实际生产中，会出现提取物溶解不充分等情况，导致有效成分的损失，直接影响最后的成品质量，因此，亟需引入1种快速检测方法，降低生产过程控制风险。本实验将NIRS和MIRS技术与化学计量学结合，首次应用于RI制剂过程，建立投料和二次热处理工序6种关键质控指标的偏最小二乘（partial least squares，PLS）定量校正模型，实现对绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量的快速测定。

1 材料与仪器

1.1 材料

59批次的投料工序样本（批号Z220123～Z2201240、Z220201～Z220232、Z220301～Z220309）及对应批次的59批次的二次热处理工序样本，共118批次样品，由江苏康缘药业股份有限公司水针车间提供。对照品绿原酸（批号110753-202018，质量分数96.1%）、栀子苷（批号110749-201919，质量分数97.1%）购自中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸（批号DSTDX001503，质量分数99.58%）、断氧化马钱子苷（批号DST211224-111，质量分数98.87%）购自成都乐美天医药-德思特生物技术有限公司；隐绿原酸对照品（批号ST07850120，质量分数98.04%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.2 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪、Antaris II型傅立叶变换NIRS仪，配有透射检测器、采样软件以及Result、CAMO等数据处理软件，（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；React IR 702L型MIRS仪、XP6型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BSA 224S-CW型万分之一电子天平，德国Sartorius公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Academic型纯水机，美国Millipore公司。

1.3 数据处理软件

采用Unscramble X 10.4（挪威Camo Analytics公司）软件进行光谱预处理；采用GraphPad Prism 8.0（美国GraphPad Software）绘图；采用Matlab R2018a（美国MathWorks公司）软件进行样本划分、波段筛选及模型构建。

2 方法与结果

2.1 NIRS的采集

以空气为扫描背景，采用NIRS技术于室温下采集光谱，选择1 mm比色皿，光谱扫描范围4000～10 000 cm−1，扫描次数为64次，分辨率4 cm−1，衰减器选择B模块，1倍增益，每个样品采集3次，取平均光谱，得到59批投料工序样本及59批二次热处理工序样本，共计118个样本。NIRS结果见图1。

2.2 MIRS的采集

在室温条件下，使用光纤探头扫描样品，以空气为扫描背景；光谱扫描范围3000～650 cm−1；扫描次数32次；分辨率8 cm−1；增益选择“low”，每个样品扫描2次，取其一作为样本光谱，得到59批投料工序样本及59批二次热处理工序样本，共计118个样本。MIRS结果见图2。

图1 118批样本的NIRS平均光谱图

图2 118批样本的MIRS图

2.3 5种质控指标含量的测定

2.3.1 HPLC分析色谱条件 参照崔小弟等[12]的实验结果，色谱条件设为Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，6 μm）色谱柱；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；体积流量0.7 mL/min；进样量10 μL；柱温20 ℃；检测波长238、327 nm。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密吸取1 mL样品置于20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3 样品测定 取118批次样品，按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项色谱条件进样测定，每份样品平行2次测定，取平均值，作为建模的质控指标含量实测值。6种质控指标的含量测定结果见表1。

2.4 固含量的测定

参照文献方法[13-14]，称取约5 g样品至已烘干至恒定质量的称量瓶（0）中，称定质量（1），置烘箱105 ℃条件下烘干5 h至恒定质量，计为2。

表1 样本中6种质控指标统计值(n = 2)

Table 1 Statistical values of six quality control indicators in samples (n = 2)

质控指标质量浓度/(mg·mL−1)固含量/% 绿原酸新绿原酸隐绿原酸栀子苷断氧化马钱子苷 最小值8.768 82.066 82.304 312.285 41.116 27.295 3 下四分位数9.405 62.349 42.601 212.791 31.178 77.765 5 上四分位数10.279 12.619 42.898 014.254 11.432 78.221 8 最大值10.606 12.809 43.052 015.311 11.506 98.725 7 均值9.851 82.478 32.740 813.633 51.302 37.995 1

固含量＝(2－0)/(1－0)

2.5 校正集与验证集的划分

采用Kennard-Stone（K-S）划分法[15]，将收集的59批投料工序样品以及对应批次的59批二次热处理工序样品，共计118批样品，以4∶1的比例划分为校正集和验证集，最终得到校正集样本94个，验证集样本24个。

2.6 光谱预处理

采集光谱时，由于受到环境温度、湿度、仪器状态、杂散光和随机噪声等因素的影响，红外光谱会出现基线漂移和噪声干扰等问题，因此，在建模前对光谱进行适当的预处理是有必要的，可以有效地减少噪声，净化无用信息，提高模型的精度和预测效果。常见的预处理方式有：移动平均法（moving average，MA）、Savitzky-Golay（S-G）平滑法、导数法（一阶导数、二阶导数）、矢量归一化法、基线校正、标准正态变换（standard normal transformation，SNV）、多元散射校正（multivariate scattering correction，MSC）以及上述方法的结合。MA和S-G平滑法可以消除光谱信息中的随机噪声，提高信噪比；一阶导数可以消除背景的常数平移，二阶导数可以消除背景的线性平移，消除背景漂移造成的影响；矢量归一化法通过增强光谱数据间的差异，校正由光程变化或者样品浓度改变引起的光谱变化；基线校正可以消除仪器背景漂移对信号的影响；SNV和MSC可以消除由于样品分布不均匀对光谱造成的影响[16]。

本研究采用MA、S-G平滑、S-G 1st、基线校正、归一化法以及SNV分别对NIRS和MIRS进行预处理，并分别建立投料和二次热处理工序的6种质控指标的PLS定量校正模型。根据模型评价指标筛选出最佳的光谱预处理方法，使用留一交叉验证法确定校正模型中的最佳的潜变量数（latent variables，LVs），以预测相对误差（relative standard error of prediction，RSEP）为主要评价指标，RSEP值越小越好。一般而言，性能优异的预测模型应具有较高的校正集相关系数（cal）及验证集相关系数（pre）、较小且接近的校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）和交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及较低的RSEP[17]。上述评价指标的相关公式为式（1）～（4）。

cal＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（1）

pre＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（2）

RMSEC＝[∑(－y)2/]1/2（3）

RSEP＝[∑(－y)2/∑2]1/2（4）

、为校正集、验证集样本数，为实测值，y为预测值，y、y分别为校正集和验证集实测值的平均值

NIRS和MIRS预处理结果见表2、3，可以发现：基于NIRS，当绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量分别以SNV、MA、MA、无预处理、SNV和归一化法为预处理方法时，RSEP最小，且都在4.0%以下，此时，cal与pre值较大，RMSEC与RMSECV值较小且接近；基于MIRS，当绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量的预处理方法分别为无预处理、MA、MA、MA、SNV和无预处理时，模型具有较低的RSEP，均小于5%，较大的cal与pre值以及较小且接近的RMSEC与RMSECV值，从预处理方法的比较中可以猜测，在MIRS中，MA适合多数质控指标，可能是由于其减轻了光谱信息自身携带的随机误差，提高信噪比。

2.7 光谱波段的筛选

全光谱模型的准确性和稳健性可能会因为一些无关信息的存在而减弱，筛选光谱波段可以剔除无用信息，提高模型的预测精度和稳定性。本研究在上述筛选出的最佳预处理方法的基础上，对比全光谱、间隔PLS（interval PLS，iPLS）、组合间隔PLS（synergy interval PLS，siPLS）及移动窗口PLS（moving windows PLS，mwPLS）建模的效果。

2.7.1 iPLS筛选最优波段 iPLS是由Nørgaard等[18]提出的一种光谱区间筛选方法，通过将全光谱平均分为若干子区间，在各子区间内以不同的潜变量数建立独立的PLS回归模型[19]。本研究将光谱区间均分为20个子区间，并以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

2.7.2 siPLS筛选最优波段 siPLS是在iPLS的基础上，对不同子区间进行任意组合，建立所有可能的2、3或4个区间的PLS回归模型[20]。本研究将光谱区间均分为20个子区间，以子区间组合数为3建立模型，以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

2.7.3 mwPLS筛选最优波段 mwPLS的基本思想是将1个窗口沿着光谱轴连续移动，每移动1个波长点，采用交叉验证法确定最佳潜变量数并建立相应的PLS最优模型[21]。本研究以全光谱波数的10%作为窗口宽度，以RMSECV作为评价指标，筛选出最优建模波段。

表2 NIRS不同预处理方法建模结果分析

Table 2 Analysis of modeling results of different NIRS pretreatment methods

质控指标预处理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs质控指标预处理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 绿原酸无预处理0.979 80.088 10.158 50.933 31.717 515栀子苷无预处理0.975 40.187 40.257 10.974 61.100 912 MA0.976 00.096 00.164 50.924 01.828 116 MA0.979 00.203 50.276 30.972 81.168 512 S-G平滑0.975 70.096 60.159 70.926 41.788 715 S-G平滑0.972 50.197 90.269 60.974 41.120 012 S-G 1st0.982 50.082 20.186 00.922 21.818 210 S-G 1st0.998 80.041 40.290 10.948 21.551 116 基线校正0.980 00.087 80.176 40.932 01.709 315 基线校正0.974 70.189 90.274 40.975 01.132 612 归一化法0.971 30.104 70.153 80.945 51.544 112 归一化法0.998 90.039 80.177 00.975 51.077 620 SNV0.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 SNV0.999 00.038 70.175 40.974 71.086 620 新绿原酸无预处理0.834 30.096 80.127 00.829 93.934 610断氧化马无预处理0.973 00.030 2 0.049 1 0.960 22.573 814 MA0.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010钱子苷MA0.984 70.023 0 0.048 7 0.947 52.860 518 S-G平滑0.818 50.099 60.128 80.843 13.820 910 S-G平滑0.984 80.023 0 0.050 2 0.956 52.708 017 S-G 1st0.957 10.050 20.118 10.686 45.084 410 S-G 1st0.993 80.014 7 0.046 8 0.965 92.546 312 基线校正0.799 00.104 30.134 50.846 93.807 19 基线校正0.993 70.014 8 0.045 5 0.963 12.556 418 归一化法0.849 10.094 30.123 90.837 43.847 010 归一化法0.974 40.029 7 0.047 3 0.963 82.533 114 SNV0.838 30.103 10.130 80.840 13.850 69 SNV0.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 614 隐绿原酸无预处理0.872 40.085 10.111 60.942 42.591 110固含量无预处理0.973 40.077 70.131 60.941 21.378 415 MA0.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 MA0.970 50.081 80.133 20.936 11.423 917 S-G平滑0.868 00.086 50.111 60.950 22.527 310 S-G平滑0.967 70.085 50.128 80.943 91.388 215 S-G 1st0.978 00.036 30.098 50.922 23.170 511 S-G 1st0.995 50.031 90.151 70.906 21.704 714 基线校正0.882 10.082 10.110 80.941 22.725 010 基线校正0.975 10.075 30.138 60.927 71.488 515 归一化法0.881 60.082 10.108 10.949 82.548 210 归一化法0.978 20.070 40.120 60.952 91.259 115 SNV0.885 40.080 80.106 40.945 32.551 610 SNV0.978 50.069 90.119 90.948 61.309 915

除固含量的RMSEC与RMSECV的单位为“%”外，其余5种指标的RMSEC与RMSECV的单位均为“mg∙mL−1”，下表同

except the unit of RMSEC and RMSECV of solid content is “%”, the units of RMSEC and RMSECV of the other five indicators are all “mg∙mL−1”, same as the following table

表3 MIRS不同预处理方法建模结果分析

Table 3 Analysis of modeling results of different MIRS pretreatment methods

质控指标预处理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs质控指标预处理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 绿原酸无预处理0.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46栀子苷无预处理0.911 40.350 00.594 30.723 13.883 16 MA0.916 40.176 60.268 20.870 02.374 89 MA0.968 10.212 90.577 80.822 93.093 019 S-G平滑0.938 20.152 60.280 30.866 62.352 69 S-G平滑0.908 10.356 20.602 90.704 34.062 38 S-G 1st0.929 20.163 10.313 20.849 62.529 38 S-G 1st0.963 30.228 10.667 60.745 64.248 716 基线校正0.925 90.166 40.293 30.861 02.390 27 基线校正0.912 70.347 40.608 10.720 03.761 06 归一化法0.900 10.191 90.308 80.841 82.623 86 归一化法0.922 00.329 10.657 60.696 94.207 28 SNV0.909 90.182 70.312 60.836 82.639 76 SNV0.897 60.374 70.655 20.652 64.355 56 新绿原酸无预处理0.802 10.103 50.150 10.738 54.691 85断氧化马无预处理0.870 70.0650 0.1133 0.780 15.630 66 MA0.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58钱子苷MA0.836 70.0724 0.0972 0.736 46.110 47 S-G平滑0.744 80.115 70.156 40.701 74.935 95 S-G平滑0.869 90.0652 0.1112 0.739 86.084 88 S-G 1st0.798 30.104 40.163 10.774 14.728 16 S-G 1st0.967 30.0335 0.0977 0.727 37.128 516 基线校正0.815 60.100 40.154 90.721 84.877 85 基线校正0.900 60.0576 0.1121 0.802 85.308 27 归一化法0.812 90.100 90.144 10.750 74.566 55 归一化法0.883 00.0620 0.1080 0.787 85.455 56 SNV0.808 90.101 90.146 20.743 34.634 85 SNV0.897 00.0584 0.1085 0.806 85.247 96 隐绿原酸无预处理0.893 60.087 80.134 20.799 64.848 55固含量无预处理0.914 60.138 50.230 20.784 22.547 06 MA0.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 MA0.959 30.095 70.221 90.796 62.822 916 S-G平滑0.863 50.087 70.148 10.802 04.798 07 S-G平滑0.882 00.159 90.239 10.718 92.882 66 S-G 1st0.821 60.099 10.151 40.831 94.441 3 5 S-G 1st0.922 70.121 30.265 90.775 12.748 010 基线校正0.842 70.093 70.145 10.801 74.770 05 基线校正0.901 30.147 00.241 60.765 82.596 66 归一化法0.852 30.091 00.134 10.813 24.855 35 归一化法0.908 80.141 40.256 20.725 12.931 17 SNV0.847 00.092 40.137 80.822 94.587 05 SNV0.910 80.139 90.253 80.707 83.010 77

2.7.4 最优波段筛选结果 由3种波段筛选方法建立的模型与全光谱模型的性能参数对比结果见表4，以RMSEC、RMSECV和RSEP作为评价指标，综合评价，筛选出最优建模波段。结果表明，基于NIRS，绿原酸和断氧化马钱子苷的预测模型经3种方法筛选波段后，虽然建模变量数减少，但RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP均增大，模型预测性能下降，故选择全光谱区间（3 999.64～9 999.10 cm−1）建模；新绿原酸、隐绿原酸及栀子苷预测模型，采用siPLS筛选波段后，建模变量数降为465个，cal、pre均增大，RMSEC、RMSECV均减小，且RSEP均减小，模型预测性能提升，故新绿原酸、隐绿原酸及栀子苷分别选择4 601.32～4 900.23、 5 503.84～5 802.76、7 609.73～7 906.71 cm−1， 5 503.84～5 802.76、5 804.69～6 103.60、7 308.89～7 607.80 cm−1及4 300.48～4 599.39、5 203.00～5 501.92、5 804.69～6 103.60 cm−1作为最优建模波段；固含量预测模型采用siPLS筛选波段后，虽然cal、pre略微减小，RSEP略微增大，但是RMSEC、RMSECV减小且接近，故固含量选择4 300.48～ 4 599.39、5 503.84～5 802.76、7 008.05～7 306.96 cm−1作为最优建模波段。

表4 不同波段筛选方法对NIRS及MIRS的影响

Table 4 Influences of different band screening methods on NIRS and MIRS spectra

质控指标光谱筛选方法ν/cm−1rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 绿原酸NIRS全光谱3 999.64～9 999.100.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 siPLS4 300.48～4 599.39, 7 008.05～7 306.96,0.978 40.091 10.138 90.940 81.606 213 7 609.73～7 906.71 iPLS4 300.48～4 599.390.974 10.099 60.162 80.903 72.014 610 mwPLS4 387.26～4 987.020.922 70.169 70.194 30.923 91.865 78 MIRS全光谱3 000.00～648.000.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46 siPLS1 572.00～1 460.00, 1 224.00～1 112.00,0.940 60.149 60.194 30.902 42.093 712 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.886 30.205 90.244 90.826 22.743 910 mwPLS1 176.00～944.000.865 50.220 60.296 30.863 32.453 411 新绿原酸NIRS全光谱3 999.64～9 999.100.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010 siPLS4 601.32～4 900.23, 5 503.84～5 802.76,0.877 30.083 30.108 90.870 53.431 812 7 609.73～7 906.71 iPLS4 601.32～4 900.230.767 20.111 90.147 50.890 03.192 06 mwPLS6 067.60～6 676.350.673 00.128 30.145 60.762 14.545 66 MIRS全光谱3 000.00～648.000.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58 siPLS1 456.00～1 344.00, 1 340.00～1 228.00,0.800 80.103 80.121 90.738 54.661 210 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.645 40.132 70.146 70.717 24.811 18 mwPLS1 401.00～1 172.000.767 60.129 90.147 90.790 34.317 99 隐绿原酸NIRS全光谱3 999.64～9 999.100.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 siPLS5 503.84～5 802.76, 5 804.69～6 103.60,0.900 60.075 70.099 30.952 62.589 510 7 308.89～7 607.80 iPLS4 601.32～4 900.230.844 40.094 40.121 10.921 73.433 07 mwPLS4 697.75～5 297.500.872 40.085 60.169 70.855 74.340 07 MIRS全光谱3 000.00～648.000.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 siPLS1 340.00～1 228.00, 1 108.00～996.00,0.763 80.112 30.135 10.829 44.464 46 992.00～880.00 iPLS1 224.00～1 112.000.777 90.109 50.129 80.834 24.453 09 mwPLS1 412.00～1 180.000.828 70.097 20.115 20.848 44.283 211

续表4

基于MIRS，隐绿原酸预测模型经3种方法筛选波段后，虽然建模变量数减少，但cal、pre减小，RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP增大，模型预测性能下降，故选择全光谱区间（3 000.00～648.00 cm−1）建模；绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的预测模型经采用siPLS筛选最优波段后，建模变量数降为87个，cal、pre普遍增大，RMSEC、RMSECV较小且接近，RSEP均增大，模型预测性能提升，故绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量分别选择1 572.00～1 460.00、 1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm−1， 1 572.00～1 460.00、1 340.00～1 228.00、1 108.00～996.00 cm−1，1 688.00～1 576.00、1 224.00～ 1 112.00、1 108.00～996.00 cm−1及1 456.00～ 1 344.00、1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm−1作为最优建模波段；新绿原酸预测模型采用mwPLS筛选最优波段后，建模变量数降为59个，RMSEC、RMSECV较小且接近，且RSEP略微减小，模型预测性能提升，故新绿原酸选择1 401.00～1 172.00 cm−1作为最优建模波段。

2.8 PLS模型的建立

模型经过光谱预处理方法的选择、最佳的潜变量数的确定及最优建模波段的确定后，运用PLS分别建立了6个质控指标的NIRS和MIRS最佳定量校正模型，6个质控指标的NIRS模型预测效果均强于MIRS模型，故选择6个质控指标的NIRS预测模型作为最优模型，结果见表5。图3为对应的6种质控指标的最佳模型的预测值与实测值的相关性。从表5可见，对于RI制剂过程的投料和二次热处理工序的6种质控指标绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷及固含量，利用NIRS建模，其RSEP分别为1.473 4%、3.431 8%、2.589 5%、1.070 6%、2.294 6%、1.329 8%，均小于4%。而利用MIRS建模，其RSEP分别为2.093 7%、4.317 9%、4.172 6%、2.320 5%、3.816 4%、1.720 3%，均小于5%。鉴于NIRS及MIRS模型的RMSEC及RMSECV也均令人满意，可以认为NIRS及MIRS模型均满足实际运用的需要，可以快速有效地预测投料和二次热处理工序的6种质控指标的含量预测。

表5 6种质控指标的最优模型性能参数

Table 5 Optimal model performance parameters of six quality control indexes

质控指标光谱预处理方法波段筛选LVsrcalRMSECRMSECVrpreRSEP/% 绿原酸NIRSSNV全光谱120.969 90.107 20.152 50.951 91.473 4 MIRS无预处理siPLS60.940 60.149 60.194 30.902 42.093 7 新绿原酸NIRSMAsiPLS120.877 30.083 30.108 90.870 53.431 8 MIRSMAmwPLS90.767 60.129 90.147 90.790 34.317 9 隐绿原酸NIRSMAsiPLS100.900 60.075 70.099 30.952 62.589 5 MIRSMA全光谱80.830 80.096 90.145 00.870 24.172 6 栀子苷NIRS无预处理siPLS150.989 70.125 60.252 40.975 71.070 6 MIRSMAsiPLS170.966 50.218 30.324 50.888 32.320 5 断氧化马钱子苷NIRSSNV全光谱140.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 6 MIRSSNVsiPLS110.930 00.048 6 0.069 1 0.892 73.816 4 固含量NIRS归一化法siPLS130.970 20.082 20.108 10.948 31.329 8 MIRS无预处理siPLS80.903 10.145 60.166 70.899 21.720 3

图3 最佳模型中预测值与实测值的的相关性

将验证集的光谱数据导入用已建立的最佳模型中，即NIRS预测模型。根据样品的实测值和模型预测值，计算其相对误差。绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的模型预测值与样本实测值的平均绝对偏差（mean absolute，MAD）及平均相对偏差（mean relative bais，MRB）见表6，结果显示这6种质控指标的MRB均小于3.00%。

表6 验证集样本在NIRS预测模型中的预测值与实测值的对比

Table 6 Comparison of predicted and measured values in validation set samples

质控指标平均绝对偏差/(mg·mL−1)平均相对偏差/% 绿原酸0.114 11.20 新绿原酸0.070 82.90 隐绿原酸0.055 32.11 栀子苷0.118 10.89 断氧化马钱子苷0.024 81.85 固含量0.080 21.00

3 讨论

本研究首次以RI制剂过程为研究对象，采用NIRS和MIRS技术，结合PLS法，经过光谱预处理方法及建模波段筛选，建立了投料和二次热处理工序的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、断氧化马钱子苷和固含量的定量预测模型。对比NIRS和MIRS模型对6种质控指标的预测效果，可以发现，NIRS模型均优于MIRS模型，这可能与质控指标的质量浓度有关系。5种质控指标成分的平均质量浓度分别为9.851 8、2.478 3、2.740 8、13.633 5、1.302 3 mg/mL，均高于1 mg/mL，可以认为均为高质量浓度分析物，平均固含量7.995 1%亦属于高质量分数。这与Tao等[22]的研究结果相符合，即对于高质量浓度的分析物，NIRS表现出比MIRS更好的预测性能。

根据平均质量浓度对6种质控指标进一步分组，将新绿原酸、隐绿原酸及断氧化马钱子苷分为高质量浓度组，绿原酸、栀子苷及固含量分为超高质量浓度组，以预测模型的RSEP作为决定评价指标，可以发现，超高质量浓度组预测模型的RSEP均小于较高质量浓度组，可以猜测，NIRS模型对高质量浓度样品具有优异的预测效果，并且质量浓度越高，预测效果越好，后续可以通过增大样本量来验证。NIRS模型与MIRS模型预测效果存在差异，也有可能是由于NIRS相较于MIRS，其波数更多，建模变量数更多，数据中包含的信息更加丰富，使得其最终模型预测效果更佳，这也需要后续的研究证明。

本研究表明，NIRS与MIRS模型都适用于这6种质控指标的预测，2种光谱技术在离线或者在线检测方面各有所长，NIRS模型预测精度高、检测速度快、稳定性好[23]；MIRS建模参数少、仪器小巧便携，而且可以适用于混悬体系样品的检测，减少了样品的预处理过程，扩大了红外光谱的应用范围[24]，但同时MIRS对环境的要求更高，仪器位置的改变、温湿度及压力的变化、光纤的弯折程度等都会对光谱产生影响。与传统化学分析方法相比，这2种光谱分析技术更环保，耗时更少，均可以对RI投料和二次热处理工序的质控指标进行快速检测，也为后续的RI制剂过程的全工序快速检测研究奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 孙兰, 周军, 王振中. 热毒宁注射液药理作用与临床研究进展 [J]. 中国中医急症, 2014, 23(12): 2247-2249.

[2] 王高举, 焦红军. 基于网络药理学和分子对接技术的热毒宁注射液抗SARS、MERS和COVID-19的潜在共性作用机制与活性成分研究 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(5): 842-852.

[3] 新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版) [J]. 中国医药, 2022, 17(4): 481-487.

[4] Sinelli N, Cerretani L, Egidio V D,. Application of near (NIR) infrared and mid (MIR) infrared spectroscopy as a rapid tool to classify extra virgin olive oil on the basis of fruity attribute intensity [J]., 2010, 43(1): 369-375.

[5] Uríčková V, Sádecká J. Determination of geographical origin of alcoholic beverages using ultraviolet, visible and infrared spectroscopy: A review [J]., 2015, 148: 131-137.

[6] Nenadis N, Tsimidou M Z. Perspective of vibrational spectroscopy analytical methods in on-field/official control of olives and virgin olive oil [J]., 2017, 119(1): 1600148.

[7] 耿姝, 陈勇, 金叶, 等. 基于近红外技术的金银花药材多指标成分快速检测 [J]. 中国现代应用药学, 2016, 33(2): 144-150.

[8] 王磊, 杨越, 潘红烨, 等. 热毒宁注射液金银花提取过程轨迹研究 [J]. 世界科学技术—中医药现代化, 2017, 19(8): 1277-1282.

[9] 徐芳芳, 冯双双, 李雪珂, 等. 青蒿浓缩过程在线近红外快速检测模型的建立 [J]. 中草药, 2016, 47(10): 1690-1695.

[10] 吴莎, 刘启安, 吴亚男, 等. 近红外光谱对热毒宁注射液栀子萃取过程中的可行性分析 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21(1): 53-56.

[11] 王璇, 王永香, 毕宇安, 等. 热毒宁注射液中金银花和青蒿干燥工艺过程的批放行标准 [J]. 中成药, 2017, 39(10): 2059-2063.

[12] 崔小弟, 李执栋, 徐芳芳, 等. 热毒宁注射液多指标成分的一测多评法同时测定 [J]. 时珍国医国药, 2019, 30(5): 1116-1119.

[13] 金叶, 丁海樱, 吴永江, 等. 近红外光谱技术用于血必净注射液提取过程的在线检测研究 [J]. 药物分析杂志, 2012, 32(7): 1214-1221.

[14] 杜文俊, 刘雪松, 陶玲艳, 等. 热毒宁注射液金银花和青蒿(金青)醇沉过程中多指标的近红外快速检测 [J]. 中草药, 2015, 46(1): 61-66.

[15] 陈奕云, 赵瑞瑛, 齐天赐, 等. 结合光谱变换和Kennard-Stone算法的水稻土全氮光谱估算模型校正集构建策略研究 [J]. 光谱学与光谱分析, 2017, 37(7): 2133-2139.

[16] 第五鹏瑶, 卞希慧, 王姿方, 等. 光谱预处理方法选择研究 [J]. 光谱学与光谱分析, 2019, 39(9): 2800-2806.

[17] 张永超, 徐芳芳, 张欣, 等. 腰痹通胶囊4种中间体粒径的近红外光谱通用定量模型研究 [J]. 中草药, 2021, 52(1): 55-64.

[18] Nørgaard L, Hahn M T, Knudsen L B,. Multivariate near-infrared and Raman spectroscopic quantifications of the crystallinity of lactose in whey permeate powder [J]., 2004, 15(12): 1261-1270.

[19] 冼瑞仪, 黄富荣, 黎远鹏, 等. 可见和近红外透射光谱结合区间偏最小二乘法(iPLS)用于橄榄油中掺杂煎炸老油的定量分析 [J]. 光谱学与光谱分析, 2016, 36(8): 2462-2467.

[20] 王彩虹, 黄林, 刘木华, 等. 基于SiPLS模型的稻壳中重金属铬LIBS检测 [J]. 激光与光电子学进展, 2016, 53(11): 298-305.

[21] 史智佳, 田寒友, 邹昊, 等. MWPLS法在羊肉中TVB-N近红外定量分析中的应用 [J]. 食品科学, 2015, 36(20): 218-221.

[22] Tao L Y, Lin Z L, Chen J S,. Mid-infrared and near-infrared spectroscopy for rapid detection ofby a liquid-liquid extraction process [J]., 2017, 145: 1-9.

[23] 汪东升. 在线近红外检测系统的研发及在油菜籽含油率检测中的应用 [D]. 镇江: 江苏大学, 2020.

[24] 徐芳芳, 杜慧, 张欣, 等. 在线中红外光谱监测热毒宁注射液金银花与青蒿醇沉过程7种指标成分研究 [J]. 中草药, 2021, 52(10): 2909-2917.

Research on fast detection method of feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection preparation process by near-infrared and mid-infrared reflectance spectroscopy

TONG Feng1, XU Fang-fang2, 3, ZHANG Xin2, 3, LI Zhi-dong2, 3, WU Yun2, 3, ZHANG Chen-feng2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New Technology for Pharmaceutical Process of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China

The near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) and mid-infrared reflectance spectroscopy (MIRS) techniques were used to detect six quality control indexes in the feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection (热毒宁注射液, RI) preparation process, so as to improve the quality control level of preparation process.The quantitative correction models of chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, gardenoside, secoxyloganin and solid content were established by using NIRS technology and attenuated total MIRS technology, combined with partial least squares (PLS) method, after spectral pretreatment method selection and band selection respectively. Calibration set correlation coefficient (cal), validation set correlation coefficient (pre), root mean square error of calibration (RMSEC), root mean square error of cross validation (RMSECV) and relative standard error of prediction (RSEP) were used as evaluation indexes to evaluate the model performance.The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the NIRS prediction model were both less than 0.3 and close to each other, and the RSEP value were all less than 4.0%. The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the MIRS prediction model were all less than 0.4 and close to each other, and the RSEP value were all less than 5.0%. These PLS models had the advantages of good model performance and high prediction accuracy.Both NIRS and MIRS technology can be used for rapid detection of six quality control indexes in RI feeding-secondary heat treatment process, and the RSEP value is within 5%, and the method is simple and reliable.

near-infrared reflectance spectroscopy; mid-infrared reflectance spectrum; Reduning Injection; preparation process; spectral pretreatment; band screening; partial least squares; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; gardenoside;secoxyloganin; solid content

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6706 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.007

2022-05-16

2022年中央财政转移支付地方项目：基于重点研究室研究领域的中医药多学科研究能力提升项目——中药提取精制新技术

童 枫（1998—），男，硕士研究生，研究方向为中药制药过程新技术。Tel: 18851193208 E-mail: tongfeng5324@126.com

王振中，研究员级高级工程师，硕士生导师，研究方向为中药制药过程新技术。E-mail: kanionlunwen@163.com

徐芳芳，女，博士，主管药师，研究方向为中药制药过程新技术。E-mail: 879164331@qq.com

[责任编辑 郑礼胜]