隐孢子虫黏附和侵入相关蛋白的研究进展

张孝天，王璐阳，张龙现，张素梅*

（1.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450046；2.河南省人兽共患病国际联合实验室，河南 郑州 450046）

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种可引起宿主腹泻并且具有高致病性的水源性和食源性人兽共患寄生原虫[1]。主要是通过粪-口途径传播。感染后宿主主要表现为自限性腹泻，但感染免疫功能缺陷的宿主后可导致严重腹泻，甚至死亡。隐孢子虫感染的宿主种类广泛，主要包括人、哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物等。已经报道鉴定出的隐孢子虫至少有44个有效种[2]。目前，对隐孢子虫与宿主细胞之间相互作用机制的了解不够完善，因此针对其的感染尚无有效药物和疫苗。尽管美国食品药品监督管理局把硝唑尼特（Nitazoxanide）判定为治疗隐孢子虫的药物，但其只局限于儿童和免疫功能正常个体应用，对免疫功能缺陷个体（如艾滋病患者）则无明显疗效[3-4]。

隐孢子虫感染宿主细胞过程主要包括：脱囊、黏附、滑行、侵入、形成纳虫空泡等[5]，与黏附和侵入相关的蛋白在隐孢子虫感染的过程中发挥重要作用，对该类蛋白的研究有助于揭示虫病的体侵入宿主细胞的感染机制，可为开发防控隐孢子虫药物和疫苗提供参考。因此，本文对隐孢子虫黏附和侵入相关蛋白进行综述，以期为隐孢子虫病的防治提供理论基础。

1 黏附相关蛋白

目前对隐孢子虫早期感染相关蛋白研究较多，已公认参与隐孢子虫黏附的蛋白主要包括：gp40/15（gp60）、P30、GP900、TRAP、CSL、P23、CP47、CPS-500、CpClec 等。

1.1 gp40/15（gp60）gp40 与gp15 均是黏蛋白样糖蛋白，是同一基因编码的单拷贝基因，缺内含子，该基因可编码一种330 个氨基酸的黏蛋白样糖蛋白，含有一个N 端信号肽、36 个O-糖基化位点和一个指定糖基磷脂酰肌醇的C-末端疏水区[6]。Cevallos等通过外源凝集素亲和层析法试验显示，gp40 与gp15 均含有与子孢子黏附相关的乳糖/N-乙酰半乳糖特异性凝集素（Gal/GalNAc）残基，通过免疫荧光试验显示gp40 与gp15 分别位于微小隐孢子虫裂殖子和子孢子表面并能够结合形成蛋白复合体gp40/15（gp60）从而发挥黏附功能[7]。gp40/15（gp60）蛋白具有单核苷酸多态性，这对隐孢子虫指纹图谱分析、单倍型分型以及确定隐孢子虫群体遗传结构等有重要意义[8-9]。

1.2 P30P30 是一种介导虫体侵入的Gal/GalNAc，通过亲和层析方法，从微小隐孢子虫和人隐孢子虫子孢子中分离得到。P30 由含906 bp 开放阅读框的单拷贝基因编码，为含302 个氨基酸、分子量是31.8 ku 的蛋白质，在N-端含有信号肽。与gp900 和gp40 相关，均是含Gal/GalNAc 的黏蛋白样糖蛋白，可与含Gal/GalNAc 的GP900 和gp40/15 相互结合，在子孢子表面形成复合物参与子孢子的感染。体外感染微小隐孢子虫的过程中，P30 在虫体感染宿主细胞24 h 后表达。免疫荧光试验显示P30 位于子孢子的顶端区域。抗体阻断试验显示P30 多克隆抗体能有效抑制隐孢子虫对人结肠腺癌细胞（Caco-2A）的侵入[10]。

1.3 GP900Petersen 等对免疫球蛋白的研究中首次检测到具有高度免疫原性黏蛋白样的糖蛋白GP900，且为可溶性糖蛋白[11]。其可与多种鼠抗胰蛋白酶的单克隆抗体发生特异性反应，表明该蛋白在小鼠中具有很强的免疫原性。GP900 定位于微小隐孢子虫最大的一条染色体上，分子量大于900 ku，具有一个远端富含半胱氨酸的结构域和一个近端N-糖基化结构。GP900 存在于微线体内，免疫荧光试验显示GP900 位于子孢子的前部，在虫体侵入宿主时可从子孢子表面脱落。在其末端存在与子孢子黏附相关的Gal/GalNAc 残基，其特异性凝集素可阻断虫体的黏附。抗体阻断试验显示GP900 多克隆抗体能有效抑制隐孢子虫侵入宿主细胞[12]。

1.4 TRAP血小板反应相关黏附蛋白（TRAP）基因在微小隐孢子虫中较为保守，与其他顶复门原虫的血小板反应的相关黏附蛋白在结构和氨基酸序列上具有同源性（如弓形虫的MIC2 与MIC12，疟原虫的TRAP 与CTRP 等[13]），且均含有血小板反应蛋白1（TSP1）样结构域，该结构域在隐孢子虫子孢子滑行和侵入过程中发挥重要作用。如TRAP 蛋白可与肌动和肌球蛋白结合形成功能复合体，与宿主细胞表面糖胺聚糖结合介导隐孢子虫子孢子侵入过程中的滑行运动[14]。通过微小隐孢子虫基因组筛选发现了12个具有TSP1 样的结构域蛋白（TRAP-C1、CpTSP 2～CpTSP 12）。通过鉴定TRAP 蛋白在虫体侵入宿主细胞的表达规律、亚细胞定位，结合多克隆抗体阻断虫体侵入试验分析[13,15]结果表明，TRAP 蛋白可能介导虫体对宿主细胞的侵入（表1）。

表1 TRAP蛋白的生物学功能

1.5 CSLLanger 和Riggs 发现一种分子量大约为1 300 ku 的环子孢子样糖蛋白（CSL）[16]。免疫荧光试验结果显示，CSL 存在于微小隐孢子虫裂殖子和子孢子表面，在侵入宿主细胞过程中具有黏附功能。在体外试验过程中可被其单克隆抗体特异性识别，发生环子孢子样沉淀反应，进而阻止虫体子孢子侵入宿主细胞。CSL 具有高度亲和性，通过等电聚焦（IFE）分离纯化的天然CSL 在体外能够特异性与人结肠腺癌细胞Caco-2 结合，导致子孢子感染宿主细胞的能力下降，且该能力在黏附宿主细胞过程中与CSL 具有剂量依赖性[17-18]。

1.6 CP23Arrowood 等通过研究微小隐孢子虫在子孢子滑行运动过程留下的蛋白印迹时，发现一种分子量为23 ku 的糖蛋白—CP23[19]，该蛋白无疏水跨膜区，但有一个潜在的N-连接的糖基化部位，免疫荧光试验结果显示，CP23 位于隐孢子虫子孢子表面，与虫体黏附和侵入宿主细胞有关，CP23 能够与血清中的IgG 和IgA 发生特异性反应。CP23 单克隆抗体能够特异性识别CP23 的不同抗原表位，明显抑制隐孢子虫的感染。利用重组CP23 蛋白免疫BALB/c 小鼠，可诱导其产生免疫应答[20-22]。上述结果表明CP23可能介导虫体对宿主细胞的侵入。

1.7 CP47Nesterenko 等在研究微小隐孢子虫膜抗原分子与宿主细胞表面蛋白的结合能力时，发现一种CP47 膜抗原蛋白能够特异性与人和动物回肠细胞结合[23]。通过免疫电镜观察显示CP47 定位于子孢子顶端。利用CP47 蛋白对HCT-8 细胞膜蛋白进行亲和层析试验时，发现HCT-8 细胞膜蛋白中有一个57 ku的蛋白能够特异性结合CP47。并且该结合对Mn2+比较敏感，当结合缓冲液中含有10 mmol/L Mn2+时，该结合作用能够被完全抑制[24]。这些结果与早期发现的Mn2+对隐孢子虫侵入有抑制作用的研究相符。

1.8 CPS-500Riggs 利用单克隆抗体18.44 从微小隐孢子虫中鉴定出一个保守的抗原分子CPS-500，其是极性的糖脂类物质，含有多个中和抗原表位决定簇，及甘露糖和肌糖[25]。该单克隆抗体不与预先用β-甘露糖苷酶处理的CPS-500 结合，但与预先用α-甘露糖苷酶、其他α-糖苷酶和β-糖苷酶、蛋白酶处理的CPS-500 结合。表明该单克隆抗体与CPS-500 的结合依赖其抗原分子末端的β-d-甘露吡喃糖基残基。免疫荧光试验结果显示CPS-500 位于子孢子和裂殖子表面，并在虫体滑行运动中释放到基质，与虫体的黏附有关[26]。

1.9 CpClecSeema 等在隐孢子虫中发现一种典型的钙依赖的糖结合蛋白，是I 型膜蛋白，含有一个C型凝集素结构域（CTLD）、一个O-糖基化黏蛋白样结构域、一个跨膜结构域，位于虫体子孢子的致密颗粒处及顶端复合体的表面。具有黏附、信号传导的作用。目前研究发现含CTLD 的蛋白质有1 000 多种，但CpClec 是第一个在顶复门原虫中发现的含CTLD 的蛋白，体外感染微小隐孢子虫过程中，Cp-Clec 在虫体感染宿主细胞48 h 后表达量达到最高。将带Fc 标签的重组CpClec 蛋白和人盲肠腺癌细胞孵育后，通过间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验结果显示，重组CpClec 蛋白能够有效降低虫体侵入人盲肠腺癌细胞的数量。将不同的糖胺聚糖与隐孢子虫卵囊孵育后，也能降低虫体侵入人盲肠腺癌细胞的能力，其中肝素和硫酸肝素效果最明显[27-28]。表明CpClec 可以与宿主细胞表面的硫酸化糖胺聚糖特异性结合，从而介导隐孢子虫对宿主细胞的黏附。

2 侵入相关蛋白

参与隐孢子虫侵入的蛋白主要包括：Cpa135、INS、EF-1α、CP2、CpMuc、CpSUB、MEDLE、Cryptopain-1 等。

2.1 Cpa135Cpa135 由一个长度为4 671 bp 的外显子编码，包含一个SA35 肽抗原、一个ricin B 结构域、一个LCCL 结构域及酪氨酸激酶受体纤维蛋白原样结构，而且还含有顶复门原虫所具有的两个半胱氨酸富集区[29-30]。且Cpa135 与其他顶复门原虫相应蛋白氨基酸序列的同源性较高（如疟原虫中的CCP2 蛋白）。Cpa135 在隐孢子虫脱囊后开始表达，但在侵入宿主后的48 h 内检测不到。通过免疫荧光试验显示Cpa135 蛋白位于子孢子顶端，抗体阻断试验显示Cpa135 多克隆抗体能够有效抑制隐孢子虫侵入宿主细胞[31-32]。上述结果表明Cpa135 可能介导虫体对宿主细胞的侵入。

2.2 胰岛素蛋白（INS）通过比较基因组学分析发现隐孢子虫有22 个INS 基因，它们的序列各不相同。INS 是金属蛋白酶M16 家族的成员，其特征是存在Zn2+结合基序His-Xaa-Xaa-Glu-His。目前已经证实介导隐孢子虫侵入宿主的INS有7种：INS-4、INS-5、INS-6、INS-15、INS-20-19、INS-21、INS-23。通过鉴定INS 在虫体侵入宿主细胞后的表达规律、亚细胞定位，结合多克隆抗体阻断虫体的侵入试验[33-38]（抗体阻断率越高表示阻止虫体侵入效果越好）结果表明，INS 可能介导虫体侵入宿主细胞的过程（表2）。

表2 INS蛋白的生物学功能

2.3 EF-1α EF-1α 是一类可催化氨基酰-tRNA 与核糖体结合的保守蛋白，能影响蛋白质的翻译并且还能通过与原核生物中的肌动蛋白样MreB 蛋白和真核生物中的F-actin 蛋白相互作用发挥调节细胞骨架的作用[39]。在研究糖胺聚糖与微小隐孢子虫的相互作用时，发现EF-1α 可与肝素特异性结合，免疫荧光试验显示EF-1α 位于子孢子顶端。并且EF-1α 从子孢子顶端释放到宿主细胞后，聚集形成一个新月形斑块，该斑块类似于电子致密带并在虫体侵入过程结束后减弱和溶解，表明EF-1α 蛋白可能参与虫体感染部位底部电子致密带的形成，从而介导虫体的侵入。此外，抗体阻断试验发现EF-1α 多克隆抗体能有效抑制隐孢子虫侵入宿主细胞[40-43]。上述结果表明EF-1α 可能介导虫体对宿主细胞的侵入。

2.4 CP2CP2 是一种膜蛋白，通过免疫电镜发现CP2 蛋白在虫体生长发育阶段始终位于膜结构中。此外，从大配子到孢子化卵囊的发育过程中发现CP2 最初分布在子孢子表面，最后分布在纳虫空泡膜（PVM）中，表明CP2 可能参与虫体侵入宿主细胞的过程。抗体阻断试验显示CP2 多克隆抗体能有效抑制隐孢子虫侵入宿主细胞。采用qPCR 方法对微小隐孢子虫CP2 基因作为隐孢子虫标记物的有效性进行评价，结果表明CP2 基因可以作为检测微小隐孢子虫活性的最敏感、最有效、最准确的候选基因[44-45]。

2.5 CpMuc在微小隐孢子虫的基因库中发现7 个黏蛋白样糖蛋白（CpMuc-1～CpMuc-7），RT-PCR 检测结果显示，CpMuc 蛋白在虫体生长发育的各阶段均有表达。其中CpMuc-4 和CpMuc-5 蛋白在微小隐孢子虫和人隐孢子虫中的表达均差异显著，并且Cp-Muc-4 和CpMuc-5 抗体能特异性识别微小隐孢子虫裂解物中的多种多肽，表明CpMuc-4、CpMuc-5 在微小隐孢子虫的侵入过程可能易发生水解。通过免疫荧光试验显示CpMuc-4 和CpMuc-5 均位于子孢子顶端，抗体阻断试验显示CpMuc-4 和CpMuc-5 多克隆抗体均能有效抑制隐孢子虫侵入宿主细胞[46-47]。上述结果表明CpMuc-4 和CpMuc-5 可能均介导虫体对宿主细胞的侵入。

2.6 微小隐孢子虫SUB 蛋白（CpSUB）CpSUB 由一个包含906 bp 开放阅读框的基因编码，含302 个氨基酸[48]，并且与人隐孢子虫SUB 蛋白（ChSUB）的氨基酸序列98%同源。RT-PCR 检测结果显示，CpSUB蛋白在虫体生长发育的各阶段均表达。免疫荧光试验结果显示CpSUB 位于子孢子和裂殖子顶端，将感染微小隐孢子虫的初生犊牛血清经western blot 检测时发现，该血清能与CpSUB 发生特异性反应。并且发现一些蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶和其他丝氨酸蛋白酶抑制剂）也可与CpSUB 蛋白相互作用，从而有效抑制隐孢子虫感染宿主细胞[49-51]。

2.7 MEDLE通过对微小隐孢子虫全基因组测序和分析发现了MEDLE 分泌蛋白家族。该蛋白家族氨基酸序列相似，且均无保守的蛋白质结构域，在其他顶复门原虫中也无相应同源蛋白。已证实有4 个MEDLE 分泌蛋白（MEDLE-1～MEDLE-3、MEDLE-5）可能介导虫体侵入宿主细胞。通过鉴定MEDLE 蛋白在虫体侵入宿主细胞的表达规律、亚细胞定位，结合多克隆抗体阻断虫体侵入试验[52-54]结果表明，MEDLE蛋白可能介导虫体对宿主细胞的侵入（表3）。

表3 MEDLE蛋白的生物学功能

2.8 Cryptopain-1Cryptopain-1 是一种含半胱氨酸残基的蛋白水解酶，在其他顶复门原虫（弓形虫、疟原虫）中具有重要生物学意义，包括在蛋白加工、虫体侵入、营养物质吸收等过程。微小隐孢子虫Cryptopain-1 蛋白与L-型木瓜蛋白酶家族具有相同的结构特征，但无信号肽序列，并且存在跨膜结构域，可优先降解胶原蛋白、纤维连接蛋白，但不降解球形蛋白。通过免疫荧光试验发现Cryptopain-1 在卵囊和裂殖体中均有表达[55-57]，表明Cryptopain-1 可能在微小隐孢子虫侵入宿主细胞过程中发挥重要作用。表4 总结了与隐孢子虫黏附和侵入相关的蛋白。

表4 隐孢子虫的黏附和侵入相关蛋白

3 小结与展望

隐孢子虫病目前尚无有效治疗药物、疫苗，而被动免疫对隐孢子虫病有疗效。上述隐孢子虫的黏附和侵入相关蛋白可能成为被动免疫的候选靶标，其中制备这些蛋白的有效抗体可阻断虫体与宿主细胞的相互作用。本实验室利用一种多肽体外标记定量蛋白质组学技术（TMT）对微小隐孢子虫滑行状态时（3 h）和黏附/侵入HCT-8 细胞时（6 h）分泌的蛋白组进行差异性比较及生物信息学分析，结果显示共鉴定到94 种差异表达的分泌蛋白，其中表达上调的蛋白有62 种，表达下调的蛋白有32 种，这些差异表达的蛋白主要参与蛋白质翻译后修饰、蛋白质转换和分子伴侣、信号传导、分泌和膜泡运输以及细胞骨架的组成等功能。还将TMT 标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术结合使用，对奶牛源安氏隐孢子虫未脱囊和脱囊的卵囊进行相关蛋白差异性表达的比较及生物信息学分析，结果显示共鉴定到17 种蛋白在脱囊前后发生了差异表达，其中表达上调的蛋白有10 种，表达下调的蛋白有7 种，这些差异表达的蛋白主要参与蛋白质的翻译后修饰、蛋白质转换和分子伴侣等功能。后续将对这些差异蛋白深入研究，以期为隐孢子虫黏附侵入宿主细胞机制的研究及探寻潜在的药物或疫苗的靶标抗原蛋白奠定实验基础。