海洋微拟球藻对共培养三角褐指藻的分子生理学响应机制

孙诗阳，张忠义，刘 航 ，郭 栗 *，杨官品，3，4*

(1.中国海洋大学 水产学院，山东 青岛266003; 2.中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003；3.中国海洋大学 海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003；4.中国海洋大学 进化与海洋生物多样性研究所，山东 青岛 266003)

引 言

在自然界中，甘蔗植株冠层中不同特征的叶片组合可提高其对光的吸收，进而促进生长[1]，地衣则是由绿藻、蓝藻和细菌共生形成的繁殖体[2]。在农业生产中，利用田间作物的遗传多样性可降低作物病害的严重性，可能的机制是空间分割、病原体适应性进化延缓和生理逆境缓冲等[3-4]。将不同生态习性的水产动物混养同样可更高效地利用资源，减少病害发生、促进养殖动物生长[5-6]。事实上，互利共生、偏利共生和寄生是环境中不同生物间广泛存在的互作关系[7]。微藻的一些种类被广泛用作贝类、轮虫等水产动物的饵料。育苗厂在培养这些饵料藻的过程中，由于细胞密度较低、培养系统不稳定，饵料藻经常难以满足需要。虽然某些微藻，如Scenedesmusacuminatus，可经过高密度发酵获得较高生物量[8]。但更新培养设备成本高，育苗场难以承担。近些年来，人们发现通过改变培养方式，将异种微藻混养或将微藻与其它微生物共培养可在一定程度上解决这一难题。微藻与包括细菌、真菌在内的微生物共培养可提高微藻生物量和高附加值产物的积累[9-12]。共培养时，微生物可合成维生素、激素等，而微藻可利用这些物质促进生长，同时为细菌真菌提供光合产物[13-14]。由于空气-培养基交换的限制，微生物释放的二氧化碳正是微藻大规模培养时可能缺乏的物质。微生物也能将有机磷转变成无机磷，便于微藻利用[15]。不同微藻种共培养的研究也有出现[16]，但还未涉及具体的互作机制研究。

海洋微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)均是饵料藻。已有研究表明三角褐指藻可与其它微藻互作[17-19]，其全基因组序列已知[20-24]，可大规模培养[25]。海洋微拟球藻是潜在的能源微藻，其油脂和EPA含量丰富[26-27]，全基因组序列也已知[28-30]。鉴于三角褐指藻和海洋微拟球藻培养条件一致，均为海水藻种，二者或许可共培养，提高生物质积累。但两种微藻细胞在共培养后又无法进行彻底分离。因此，本研究采用交互转录组测序方法分析其相互作用的生理机制。

多物种混合转录组测序(msRNA-seq)[31]包括交互转录组测序[32](dual RNA-seq)，是一种前期不需要通过物理手段分开物种细胞，而是先将混合样本中所测到的序列拼接到一起，在后期比对过程中分别以各自的参考基因组为标准进行数据分离，进而监测双方分子水平互作的方法。本研究中，我们用这种方法追踪了处于指数生长期的海洋微拟球藻与处于指数末期的三角褐指藻等细胞数共培养24 h后的转录组变化，以追踪两物种相互作用的生理学机制。本研究所建立的方法也适用于自然界或实验室中微藻-微生物互作的研究。

1 材料与方法

1.1 藻种来源与培养条件

本实验所用藻株三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和海洋微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)均来源于中国海洋大学应用微藻实验室保存的藻种。用f/2-Si 培养基在光照培养箱中培养。培养容器为100 mL拧口玻璃瓶。培养条件为：25 ℃，光照周期 12 h光照:12 h黑暗，光照强度 70 μmol m-2s-1。

1.2 生长曲线绘制及共培养处理

每隔1 d，在培养箱不同的三层中各取一个培养瓶作为三个平行样本测定细胞密度。用显微镜和细胞计数板对不同培养瓶内的三角褐指藻和海洋微拟球藻分别进行计数[33]。用Origin作图软件作图。共培养时，取指数末期的三角褐指藻藻液，去除培养基成分，重悬离心后以等细胞数与对数生长期的海洋微拟球藻混合。

1.3 交互RNA-seq建库测序与数据处理

取三角褐指藻与海洋微拟球藻共培养初始时刻(0 h)和共培养24 h后的共培养物(平行样本用r1，r2表示)，收集细胞，用TRIzol试剂盒(Invitrogen, USA)提取总RNA[34]。离心收集藻细胞并用3% NaCl溶液清洗，液氮中研磨，重悬于1 mL TRIzol中，摇匀，在室温下放置5 min后离心取上清液，并与200 μL氯仿混合，混匀，放置5 min后离心取上清液。重复这一步骤直至上清液完全澄清。将上清液与500 μL异丙醇混合，-20 ℃静置1 h，室温静置10 min，加入1 mL 70% 乙醇沉淀、清洗RNA。将RNA室温干燥后悬于30 μL DEPC处理水中。用琼脂糖凝胶电泳、Nannodrop2000 分光光度计、Qubit2.0 荧光光度计、Agilent2100进行RNA浓度、完整性和纯度的检测。

用3 μg总RNA和试剂盒(Illumina NEBNext®UltraTMRNA Library Prep Kit)构建测序文库。用 Oligo(dT)磁珠富集mRNA带，在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子打断mRNA。用寡核苷酸为引物和M-MuLV逆转录酶合成 cDNA 第一条链，用 RNase H 降解 RNA模板，用DNA polymerase I合成 cDNA 第二条链。双链 cDNA 经末端修复、加A尾后连接测序接头。用AMPure XP beads筛选 200 bp左右的cDNA，PCR 扩增，用 AMPure XP beads 纯化 PCR 产物，获得文库。文库构建完成后先使用 Qubit2.0 Fluorometer 进行初步定量，稀释文库至 1.5 ng/μL，用 Agilent2100 bioanalyzer检测插入片段大小。用qRT-PCR确定文库有效浓度。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量需求混合进行 Illumina 测序,产生150 bp两端短读序。

测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经 CASAVA 碱基识别转化为序列数据(reads)，文件为 fastq格式，其中主要包含测序片段的序列信息以及对应的测序质量信息。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤来去除带接头(adapter)的、含有不明碱基的以及低质量的读序。

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上下载三角褐指藻与海洋微拟球藻参考基因组序列，整合成参考基因组[35]，过滤掉比对到多个位置的读序，然后分开两种微藻的读序，独立分析海洋微拟球藻和三角褐指藻的基因表达。使用 HISAT2 v2.0.5[36]构建参考基因组的索引和比对。用Feature Counts计算映射到每个基因的读序，根据基因长度计算每个基因的 FPKM(每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量)，并计算映射到该基因的读序。每个测序文库，通过一个比例归一化因子通过 edgeR 程序包调整读取计数。差异表达分析使用edgeR R 软件包(3.18.1)进行。使用 Benjamini & Hochberg方法调整P值。将校正后的P值以及|log2foldchange|作为显著差异表达阈值。使用DESeq2R统计软件(1.16.1)基于负二项式分布的模型来进行两个比较组合间的差异表达分析(每个组两个生物学重复)。同样使用 Benjamini和Hochberg 的方法来调整所得 P 值以控制错误发现率，并将调整的P值小于0.05的基因视为差异表达基因。通过 clusterProfiler R软件基于超几何分布原理实现差异表达基因的 GO(Gene Ontology，http://geneontology.org/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/)富集分析。

2 结果

2.1 生长情况

海洋微拟球藻在加入三角褐指藻后的8 d中与单独培养相比其生长出现了停滞，三角褐指藻细胞数目与初始状态相比也无显著变化(图1)，表明这是一种对双方均有消极影响的相互作用(Negative bidirectional interaction)[37]。

图1 三角褐指藻正常生长曲线(A)和共培养体系中(B)中三角褐指藻(红色)、未混合时海洋微拟球藻(蓝色)、混合三角褐指藻后(绿色)的生长曲线

2.2 海洋微拟球藻基因表达及通路富集

海洋微拟球藻处理组与对照组的平行样本间重复性良好，皮尔森指数分别为0.992和0.996。表达的基因有8 235个，其中7 426个基因表达倍数无显著差异，809个有显著差异，351个为下调表达，458个为上调表达(图2)。

图2 对照组(N. oceanica，0 h r1，r2)和处理组组(N. oceanica, 24 h r1, r2)差异基因聚类(A)和火山分布图(B)

共有7条KEGG通路被富集(表1)。一条通路中呈上调或下调表达的基因占优势，我们就认为该通路整体上调或下调。分析发现，下调通路有DNA复制和同源重组，上调通路有氨基和核苷酸糖代谢通路、Focal adhesion和PI3K-Akt、cAMP和ErbB信号通路。DNA复制(KEGG03030)和同源重组(KEGG03440)通路的下调可能是海洋微拟球藻在与三角褐指藻共培养后生长停滞的主要原因。氨基和核苷酸糖代谢通路则与细胞壁的维护和修复有关，它的上调说明三角褐指藻可能分泌了对海洋微拟球藻细胞壁造成消极影响的物质。ABC转运蛋白家族中19个基因总体上呈上调趋势，这也暗示海洋微拟球藻存在运输三角褐指藻可能分泌物的可能。Focal adhesion、cAMP和ErbB信号通路都可作用于PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt信号通路则作用于一系列底物，影响转录、翻译、细胞的生长周期和凋亡。这条通路上的两个重要的调节因子为phosphatidylinositol-3 kinases(PI3K)和protein kinase B(Akt)，分属磷脂激酶家族和丝氨酸/苏氨酸特异蛋白激酶，其中PI3K基因在部分微藻种中存在。PI3K-Akt信号通路是最有可能直接作用于DNA复制和同源重组的通路。

表1 微拟球藻实验组和对照组的KEGG富集情况

3 讨论

本文将海洋微拟球藻和三角褐指藻以1：1细胞数比例混合后，用交互 RNA-seq方法追踪了二者共培养24 h后的转录本变化。但由于混合的三角褐指藻处于同步化的指数末期(图1，第16天)。在新环境中需要重新启动生长过程，同时响应与海洋微拟球藻的共培养。我们无法剖分这两部分基因，选出真正参与相互作用过程的基因，解析三角褐指藻的响应机制。而在24 h内，海洋微拟球藻一直处于原环境下的指数生长期，其细胞密度也未发生显著改变。因此，其转录组的变化可反映其响应共培养的变化。鉴于本研究目的在于建立混合物种转录组测序方法，验证微藻混合培养互作的存在。因此，我们没有列举出三角褐指藻的分析结果，而是集中分析海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养的机制。

混入三角褐指藻对海洋微拟球藻的生长起到了抑制作用，使其细胞数总体上保持不变。这与三角褐指藻与牡蛎海氏藻(Hasleaostrearia)按相同细胞总体积共培养时生长情况的变化相似[38]。KEGG的富集结果显示，DNA复制和同源重组通路显著下调，而氨基和核苷酸糖代谢、Focal adhesion和PI3K-Akt、cAMP、ErbB信号通路显著上调。其中，DNA复制和同源重组通路所富集基因的一致下调阻碍了微拟球藻细胞的分裂进程，进而致使其与自然生长相比细胞数无法增加。而通过其它通路的上调，我们推测，三角褐指藻可能分泌了一类小分子化感物质。这种物质可破坏微拟球藻的细胞壁。又由Focal adhesion、cAMP、ErBb、PI3K-Akt信号通路所富集的共有基因可知这种化感物质可被微拟球藻细胞膜上的一种受体蛋白(epidermal growth factor receptor)识别并结合，该蛋白主要结合的是多肽类物质，而曾有研究从三角褐指藻的培养基中鉴定出一些可以对Heterosigmaakashiwo产生消极影响的成分，其中一种C30H38N6O6就属于谷氨酰胺[18]。ABC 转运蛋白家族基因在以往处于高盐、添加镉离子逆境下的一些微藻种中的高倍数表达[39-42]也辅助暗示了本实验中向胞外运输化感物质的存在。Focal adhesion通路中的基因编码FG-GAP repeat，负责调节细胞的黏附性[43]。cAMP信号通路中的P-type ATPases基因[44]表示该通路主要是对环境中加入了三角褐指藻后营养物质浓度变化的响应，而PI3K-Akt信号通路中富集的Myb-like DNA-binding domain基因隶属于转录因子家族，可与DNA结合[45]，表示该信号通路有可能直接作用于DNA复制及同源重组过程。海洋微拟球藻也可能以同样方式影响三角褐指藻生长(图3)。真实的细胞外互作机制需要后续研究分析。

图3 海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养的可能生理机制

多物种混合转录组测序(msRNA-seq)已被用于自然生态系统或人为构建共培养系统中微藻间或微藻-微生物间互作机制的研究[31,46]。它破除了物理分离物种细胞的限制，通过测序数据分离实现各自基因的表达分析。在研究中，我们用交互转录组测序(dual RNA-seq)，msRNA-seq最约减形式，来解释海洋微拟球藻响应三角褐指藻共培养的生理机制。数据处理中，我们过滤掉了能同时匹配到两物种或在一个物种中可以匹配两个及两个以上位置的读序。这可能影响物种内同源基因或两个物种间同源基因的表达量。但这部分过滤掉的序列小于4%。我们相信这样的过滤不会影响分析和结论获取。结合Dual RNA-seq以往的应用情况可知，它不仅可以用于寄生中两个亲缘关系相差甚远的物种组合，也适用于两种真菌或细菌这样亲缘关系相近的竞争及互利共生关系组合[31]，在本文两种藻类之间的成功应用也验证了这一点。这些实验设计的总体思路均是围绕着一个互作过程展开，值得注意的是对照样本和细胞状态的选择，在以后的应用中应根据实验目的选择互作初始时间点或单独培养的二者细胞作为对照，细胞状态也应保持一致，尽量同步在一样的生长时期中。

参考基因组是将两物种混合样本中测序数据分开的必需依据。本研究中，两个微藻种均具有高质量的参考基因组序列。但因技术、成本、特殊生物特性的限制，很多物种还无法进行全基因组测序。全长转录组测序[47-49](full-length transcriptome sequencing)和单细胞基因组测序[50](single cell genome sequencing)可解决无参考基因组问题。随着测序技术的不断进步，不论是自然生态系统或人为共培养系统中的物种都可以拥有自己的参考基因组或全长转录组。这将有助于更多微藻种间相互作用生理机制的探索。生化方法和仪器设备的使用可判断互作过程中双方所分泌的化学物质，而代谢组学方法的进步可极大地提高化感物质的甄别[51]。