不同生育时期水稻土壤细菌群落特征与生态功能预测

陈秋圆，赵帅兵，梁 贺，刘 晔，崔燕妮，彭 廷，2，赵全志，2，张 静，2

(1．河南农业大学 农学院，河南省水稻生物学重点实验室，河南 郑州 450046；2．河南农业大学，水稻河南省工程实验室，河南 郑州 450046)

水稻(Oryzasativa)是我国三大粮食作物之一，近些年，探究水稻产量形成的生理生态机制是农业工作者关注的焦点之一。水稻产量构成要素包括穗数、穗粒数、千粒质量和结实率[1]。氮素是水稻必需营养元素之一。在适宜的施氮量条件下，氮肥一般分3～5次施入大田，通常以基蘖肥和穗粒肥方式按一定比例施用。基蘖肥中氮肥除作为基肥外，分蘖肥通常在水稻插秧7 d后施入；穗粒肥则分别在孕穗期和抽穗期施入。分蘖期和拔节—孕穗期是水稻穗数和穗粒数形成的关键时期。合理施用分蘖肥可提高有效分蘖，控制无效分蘖。在穗轴分化期和花粉母细胞减数分裂期施用穗肥可促进枝梗和颖花分化、减少颖花退化，有利于千粒质量和结实率的提高。前人研究发现，土壤微生物在植物生长发育过程中的作用不容忽视。水稻内生细菌、土壤细菌群落与穗粒数呈显著正相关关系；稻田土壤细菌的增加，可改善土壤细菌群落结构，增加水稻穗数和穗粒数[2-4]。因此，稻田土壤微生物中细菌与水稻产量及其构成要素形成关系密切，是实现水稻高产、稳产的重要生态因子之一[5]。

随着高通量测序技术和生物信息学研究的发展，16S rRNA扩增子测序技术已成为研究环境微生物群落结构和组成的重要手段。国内外研究学者已有较多关于水稻[6-8]、小麦[9-11]、玉米[12]等作物土壤细菌群落结构方面的研究报道，发现稻田土壤优势菌群主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等[13-16]。随着施氮量增加，土壤细菌群落多样性呈上升趋势[17]。长期施肥条件下，土壤细菌多样性及数量均较不施肥处理显著增加[18]。已有报道指出，分蘖期稻田土壤微生物数量多、种类复杂、代谢能力强[19]。拔节—孕穗期是决定穗粒数多少的关键时期[20-21]。与分蘖期相比，孕穗期稻田土壤细菌群落结构存在显著变化[22]。但不同生育时期水稻土壤细菌群落组成与结构、生态功能与产量间的关系报道较少。由于水稻高产栽培管理过程中，氮肥多以基蘖肥与穗粒肥按6∶4或7∶3的比例施入，因此，以2个高产水稻品种为材料，通过设置2个氮肥施用比例处理，采用 Illumina MiSeq 高通量测序技术，研究水稻分蘖期、拔节—孕穗期土壤细菌群落组成与结构、生态功能的差异，及其与土壤氮素、水稻产量的关系，旨在为深入解析土壤微生物在水稻产量形成中的作用机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 种植材料

2个水稻品种为Y两优900和早丰优69。

1.2 试验设计

试验在河南农业大学信阳教学试验基地(34°34′ N，115°33′ E)进行，设2种氮肥施用比例，基蘖肥和穗粒肥比例分别为6∶4(即基肥为40%，分蘖肥为20%，穗粒肥为40%)和7∶3(即基肥为40%，分蘖肥为30%，穗粒肥为30%)，总施氮量均为277.5 kg/hm2。小区面积60 m2，3次重复。基肥施750 kg/hm2复合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)，分蘖肥以尿素形式施入。穗粒肥追施尿素分2次施入，倒四叶施入60%，剩余部分在倒二叶时施用。磷肥和钾肥与氮肥的施用比例为N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶1，磷肥按1∶1的比例分别随基肥和穗粒肥施入，钾肥随基肥一次性施入土壤。水稻于2015年4月30日播种，5月20日移栽，行株距为30 cm×21 cm，每穴2株。试验期间其他田间栽培管理方式与当地保持一致。该地土壤pH值6.40，有机质含量29.30 g/kg，全氮含量1.00 g/kg，碱解氮36.75 mg/kg，速效磷16.50 mg/kg，速效钾13.94 mg/kg。

1.3 水稻产量及其构成要素测定

成熟期选取长势一致的2 m×2 m样块进行产量的测定，并调查各小区200穴记录有效穗数，按照各小区有效穗数均值选取3株考种，测定穗粒数、结实率、千粒质量等。

1.4 土壤样品采集

分别于水稻分蘖期和拔节—孕穗期取0～20 cm土壤样品，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱待测。

1.5 土壤生化性质测定

1.6 土壤微生物基因组DNA提取及文库构建

土壤总DNA的提取采用Soil DNA Isolation Kit 试剂盒(Mo Bio，San Diego，CA)。以基因组DNA为模板，用简并PCR引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，对16S rRNA基因的可变区V4进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增，磁珠筛选目的片段，用合格文库进行Cluster制备，设置30 bp窗口长度，通过Illumina平台(Hiseq或Miseq)进行Paired-end测序[29-30]。

1.7 数据分析

16S rRNA扩增子数据主要运用QIIME 2进行分析[31]，测序数据经过滤、裁剪和拼接后形成Tags，用QIIME 2脚本中的DADA2进行质控，并生成代表性序列和特征表(ASV表)，之后用SILVA数据库进行物种注释。基于ASV表和物种注释结果的分析及可视化通过R Studio(Version 4.1.0)软件实现，包括采用QIIME 2和Vegan 2.5-7包分别进行Beta多样性分析和冗余分析[32]，使用edgeR 3.36.0包进行差异分析 (Wilcoxon rank sum test)[33]，差异ASV筛选标准为FDR(False discovery rate)< 0.05，采用ggplot2 3.3.5包[34]作图。土壤细菌群落结构的功能预测采用FAPROTAX(Functional annotation of prokaryotic taxa)方法[35]，并利用Pheatmap 1.0.12包绘图[36]。使用SPSS 22.0 软件进行Pearson相关系数计算及方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同生育时期稻田土壤氮素、细菌数量的差异分析

由表1可见，土壤氨氧化潜势、硝化强度、硝态氮、铵态氮、全氮含量和细菌数量均在2个生育时期间存在显著或极显著差异。分蘖期7∶3处理中，Y两优900土壤氨氧化潜势和硝化强度均显著低于早丰优69(P<0.05)。拔节—孕穗期早丰优69土壤铵态氮含量在2个氮肥处理中均显著高于Y两优900(P<0.05)，硝化强度则低于Y两优900(P<0.05)；7∶3处理下，早丰优69土壤全氮含量显著高于Y两优900(P<0.05)。拔节—孕穗期，早丰优69土壤细菌数量7∶3处理比6∶4处理多35.31%。同时，土壤细菌数量还受到生育时期、氮肥及生育时期和品种交互作用的影响。

2.2 水稻产量及其构成要素与不同生育时期土壤生化因子的相关性分析

从产量及其构成要素来看(表2)，穗粒数、结实率和产量在2个品种间均存在显著或极显著差异，2个施氮比例对产量及其构成要素无显著影响。Y两优900的结实率在2个施氮处理下均显著低于早丰优69(P<0.05)。早丰优69穗粒数在6∶4和7∶3处理中分别比Y两优900显著增加了32.52，63.29粒。早丰优69在7∶3处理的产量比Y两优900提高10.63%。由相关性分析可知(表3)，产量与分蘖期土壤细菌数量呈显著负相关关系(P<0.05)，而与拔节—孕穗期的细菌数量呈显著正相关关系(P<0.05)，分蘖期细菌数量与有效穗数存在显著正相关关系(P<0.05)，穗粒数与分蘖期和拔节—孕穗期的土壤氨氧化潜势均呈显著正相关关系(P<0.05)，分蘖期土壤全氮含量与穗粒数呈显著负相关(P<0.05)，拔节—孕穗期土壤全氮含量与产量存在显著正相关关系(P<0.05)。由此可见，水稻产量、有效穗数和穗粒数受到土壤细菌、氨氧化潜势和全氮的调控。

表1 不同处理土壤生化因子含量变化Tab.1 Changes in the content of soil biochemical factors in different treatments

表2 不同处理水稻产量及其构成要素Tab.2 Rice yield and yield components in different treatments

2.3 不同生育时期稻田土壤细菌群落结构的差异分析

高通量测序结果显示，24个土壤样品共得到844 532条有效序列，通过QIIME 2将优化序列在100%相似度下进行聚类，获得5 868个ASV。以Bray-Curtis距离做非限制性主坐标分析(Principal coordinate analysis，PCoA)结果显示 (图1)，稻田土壤细菌群落在第一主坐标轴(PCo1)上按时期被分成2簇，其贡献率为17.05%，品种是第2主坐标轴(PCo2)上样品差异的主要因素，PCo2的贡献率为10.09%，表明不同生育时期会导致稻田土壤细菌群落结构变化，同时，稻田土壤细菌群落结构还受到品种的影响。

2.4 不同生育时期稻田土壤细菌群落组成的差异分析

分蘖期和拔节—孕穗期Y两优900和早丰优69的稻田土壤优势菌群组成在不同分类水平存在差异(图2)。在门和纲水平上，分蘖期的绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度比拔节—孕穗期高6.16 百分点，其中Y两优900高出9.35百分点，早丰优69高出2.97百分点；拔节—孕穗期的变形菌门相对丰度比分蘖期高0.69百分点，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)相对丰度比分蘖期高1.66百分点，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)相对丰度比分蘖期低0.27百分点；拔节—孕穗期的拟杆菌门相对丰度比分蘖期高1.09百分点，早丰优69土壤中拟杆菌门相对丰度比Y两优900高2.88百分点；分蘖期的酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度比拔节—孕穗期高出2.65百分点。

表3 土壤生化因子与产量及其构成要素的相关性分析(n=12)Tab.3 Correlation analysis between soil biochemistry indexes and yield，its components

分蘖期和拔节—孕穗期Y两优900和早丰优69土壤中富集的ASV存在重叠，Y两优900在2个生育时期土壤中共同富集25个ASV，占分蘖期富集的56.81%，占拔节—孕穗期富集的43.86%(图3-A)，主要属于绿弯菌门、变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门(图3-B)。早丰优69土壤中有8个ASV在2个生育时期中共同富集，占分蘖期的32.00%， 拔节—孕穗期的42.10%(图3-C)，主要属于厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和绿弯菌门 (图3-D)。分蘖期和拔节—孕穗期富集的ASV在Y两优900和早丰优69土壤中也存在重叠，拔节—孕穗期有15个ASV在2个品种中共同富集，占Y两优900的88.23%，早丰优69的71.43%(图3-E)，这15个 ASV主要属于变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门(图3-F)；分蘖期有24个ASV在2个品种中共同富集，占Y两优900的77.42%，早丰优69的64.86%(图3-G)，这24个ASV主要属于绿弯菌门、变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门(图3-H)。总的来说，ASV水平上2个生育时期间差异富集的细菌在门水平包括绿弯菌门、变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门；2个品种间差异富集的细菌在门水平主要为绿弯菌门、变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。

Y.Y两优900；Z.早丰优69；T.分蘖期；J.拔节—孕穗期。图2—5同。Y.Y Liangyou 900；Z.Zaofengyou 69；T.Tillering stage；J.Jointing—booting stage.The same asFig.2—5.

Y-6∶4.氮肥比例6∶4处理的Y两优900；Z-6∶4.氮肥比例6∶4处理的早丰优69；Y-7∶3.氮肥比例7∶3处理的Y两优900；Z-7∶3.氮肥比例7∶3处理的早丰优69。其他指相对丰度排名前10以外的其他细菌。因变形菌门丰度较高，相对丰度为纲水平，其余为门水平。

A.2个时期Y两优900土壤富集的ASV；B.2个时期Y两优900土壤富集ASV的组成；C.2个时期早丰优69土壤富集的ASV；D.2个时期早丰优69土壤富集ASV的组成；E.拔节—孕穗期土壤富集的ASV；F.拔节—孕穗期土壤富集ASV的组成。G.分蘖期土壤富集的ASV；H.分蘖期土壤富集ASV的组成。

2.5 不同生育时期稻田土壤优势细菌与环境因子的RDA分析

将稻田土壤理化性质与相对丰度前十的细菌门(纲)进行冗余分析(RDA)发现，2个生育时期(图4-A、B)和2个品种(图4-C、D)的稻田土壤优势细菌群落组成存在差异，且受到土壤理化因子的影响。由图4-A可知，RDA1对因变量矩阵贡献率为55.00%，RDA2对因变量贡献率为18.88%，其中铵态氮对分蘖期稻田土壤微生物群落影响极显著 (P<0.01，表4)。由图4-B可知，2个坐标轴分别解释了52.42%和23.70%的拔节—孕穗期稻田土壤微生物群落变化，其中氨氧化潜势对拔节—孕穗期稻田土壤微生物群落的影响达到显著水平(P<0.05，表4)。

A.分蘖期环境因子与稻田土壤细菌群落结构的RDA分析；B.拔节—孕穗期环境因子与稻田土壤细菌群落结构的RDA分析；C.Y两优900品种环境因子与稻田土壤细菌群落结构的RDA分析；D.早丰优69品种环境因子与稻田土壤细菌群落结构的RDA分析。

2.6 不同生育时期稻田土壤细菌生态功能预测

利用 FAPROTAX对高通量测序所得的5 868个ASV进行生态功能预测发现(图5)，不同生育时期稻田土壤细菌生态功能在品种和氮肥处理间具有较大差异。与氮循环功能有关的一氧化二氮反硝化作用、亚硝酸盐反硝化作用、硝酸盐反硝化作用和反硝化作用等功能均表现出分蘖期7∶3处理下丰度较高，尤以Y两优900稻田土壤中相对丰度最高。说明施氮比例和品种的不同引起了土壤氮素反硝化作用的变化，分蘖期7∶3氮肥处理下土壤细菌的反硝化功能增强。

图5 不同处理间稻田土壤细菌功能相对丰度差异热图Fig.5 Heat map of differences in relative abundances of soil bacterial functions in paddy soils among different treatments

3 结论与讨论

综上所述，施氮比例7∶3和6∶4处理下，水稻分蘖期土壤细菌数量增加可促进有效穗数的形成，拔节—孕穗期土壤细菌数量的增加有利于水稻产量的形成。土壤细菌群落构成及生态功能在分蘖期和拔节—孕穗期2个生育时期间存在明显差异。拔节—孕穗期较高的土壤氨氧化潜势，有利于水稻穗粒数的增加。分蘖期7∶3处理的土壤氨氧化潜势高于6∶4处理，且土壤细菌的反硝化功能较强，产量较低的Y两优900土壤细菌的反硝化功能高于产量较高的早丰优69。因此，稻田土壤细菌数量、细菌群落构成与生态功能的差异可影响水稻有效穗数、每穗粒数和产量的形成。