10-DAB分子印迹纳米微球的合成及吸附性能研究

王奕洁, 江哲恒, 孙雯佳, 武晓丹, 曹劲松, 付玉杰*

(1.东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北林业大学 化学化工与资源利用学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)是一个二萜类紫杉烷衍生物[1],主要分布于红豆杉属植物[2]的树皮、枝条、根、种子和芯材中,在枝叶中含量最高[3]。10-DAB化学结构式与紫杉醇非常相近[4]，是合成抗癌药物紫杉醇和多烯紫杉醇的重要前体产品[5]，具有很高的应用价值[6]。目前，红豆杉中提取10-DAB的方法主要包括溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法、浸渍法、渗漉法、加热回流法等[7]，然而上述方法普遍存在溶剂消耗量大、环境污染严重、操作过程复杂、产率低、产物杂质较多等问题[8]。所以，需寻找一种高效、方便、绿色、环保的方法[9]对植物中的10-DAB进行特异性识别分离[10]，从而为植物活性成分的高效分离提供科学基础[11]。分子印迹技术(MIT)是近年来被广泛应用于天然产物的分离应用中，集分子设计、分子识别、仿生生物工程等[12]众多学科优势发展起来的一门学科分支，具有预定性、识别性和实用性的特点[13]。何慧清等[14]通过沉淀聚合法合成了白藜芦醇分子印迹聚合物微球，该材料对白藜芦醇最大吸附量可达16.80 mg/g；楚善明等[15]采用回流沉淀聚合法与复合模板技术相结合，以槲皮素与橙皮素作为复合模板分子，合成了对天然产物中黄酮类化合物具有选择性的分子印迹聚合物，吸附量范围在37.54～49.82 mg/g之间；闫艳等[16]合成了对紫杉醇有亲和性和选择性的分子印迹聚合物，但以10-DAB为模板的纳米级分子印迹材料未见报道。本研究通过沉淀聚合法成功制备了10-DAB分子印迹纳米微球(10-DAB-MINs)来进行10-DAB的高效富集，确定了10-DAB-MINs的最佳制备条件，并通过吸附动力学和吸附等温线探讨了吸附机理，以期为10-DAB的高效分离提供一种新思路。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)，购自天津希恩思生化科技有限公司；4-乙烯基吡啶(4-VP)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)，均购自阿拉丁(上海)有限公司。甲醇、乙腈、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇等其他试剂，均为市售分析纯。

KQ-250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DGX9073型真空干燥箱；JSM-7500F扫描电子显微镜(SEM)，日本JEOL公司；Zeta PALS激光粒度分析仪；miniX全自动比表面积及孔径分布测定仪，日本Microtrac BEL公司；IR Affinity-1S傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪，日本岛津公司；热重分析(TG)仪，美国珀金埃尔默公司；反相高效液相色谱(RP-HPLC)，安捷伦公司。

1.2 10-DAB-MINs的制备

取0.05 mmol 10-DAB、0.5 mmol 4-VP分散于装有40 mL甲醇的圆底烧瓶中，超声波溶解后于室温下避光搅拌8 h制备预聚体；之后，在溶液中加入1.5 mmol交联剂EGDMA、1.22×10-3mmol引发剂AIBN，在氮气保护下，油浴环境中60 ℃反应24 h进行聚合反应；反应结束后，收集聚合物[17-18]。用甲醇/乙酸(体积比9∶1)进行多次洗脱去除模板分子10-DAB，直至洗脱液中检测不到10-DAB。NINs的合成方法与10-DAB-MINs相同，只是合成过程中不添加模板分子10-DAB[19]。将10-DAB-MINs和NINs常温下进行干燥，以备进一步实验使用。

1.3 10-DAB-MINs的吸附机理探究

1.3.1吸附动力学 在20 mL质量浓度0.2 g/L的10-DAB标准溶液中，加入10-DAB-MINs(NINs)20 mg，放入摇床中在室温下吸附5、10、15、20、30、40、60、120、240和360 min后离心。采用HPLC测定不同时间上清液中10-DAB的质量浓度，并根据式(1)[20-21]计算不同时间10-DAB-MINs(NINs)的吸附量，并绘制吸附量与吸附时间的吸附曲线。

(1)

式中：C0—10-DAB的初始质量浓度，g/L；Ct—t时刻10-DAB的质量浓度，g/L；V—10-DAB甲醇溶液的体积,mL；m—10-DAB-MINs(NINs)的质量，g。

采用准一级和准二级动力学模型对实验数据进行拟合，动力学模型公式可见式(2)和(3):

(2)

(3)

式中：Qe—10-DAB-MINs(NINs)在吸附平衡时的吸附量，mg/g；Qt—10-DAB-MINs(NINs)在t时刻的吸附量，mg/g；K1—准一级吸附速率常数；K2—准二级吸附速率常数。

1.3.2吸附等温线 将20 mg 10-DAB-MINs(NINs)分别置于20 mL质量浓度0.02～0.2 g/L的10-DAB标准溶液中，充分吸附24 h后离心[22]。采用HPLC法测定上清液中10-DAB的质量浓度，10-DAB-MINs(NINs)的吸附量按式(4)计算，绘制吸附等温线，并依据吸附量评价10-DAB-MINs(NINs)的吸附性能。

(4)

式中：Ce—10-DAB甲醇溶液中10-DAB平衡质量浓度，g/L。

采用Langmuir、Freundlich吸附等温模型以及Langmuir-Freundlich吸附等温模型对实验数据进行拟合，Langmuir、Freundlich以及Langmuir-Freundlich吸附等温模型的公式[23-25]如下:

(5)

(6)

(7)

式中：Qmax—10-DAB的最大吸附量，mg/g；KL—Langmuir吸附常数；KF—Freundlich吸附常数；1/n—等温平衡吸附指数；Kd—解离常数；n—异质性指数。

1.3.3循环吸附实验 样品瓶中加入20 mg的 10-DAB-MINs(NINs)，20 mL的10-DAB甲醇溶液(0.4 g/L)，置于预设温度25 ℃的摇床中。吸附24 h后，过滤分离，再用甲醇/乙酸(体积比9∶1)的洗脱液洗涤、采用HPLC测定10-DAB在甲醇溶液和解吸附溶液中的残留量。重复5次吸附，每一次吸附过程的吸附量和解吸量[25]按式(8)和(9)计算。

(8)

(9)

式中：Qa—每次循环的吸附量,mg/g；Cd—洗脱液中10-DAB的质量浓度，g/L；D—每次循环的解吸附量，mg/g；Vs—洗脱溶液的体积，1 mL。

1.3.4选择性吸附实验 称取3份10 mg的10-DAB-MINs(NINs)于样品瓶中，分别加入20 mL 0.1 g/L的10-DAB、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇的标准溶液，使其在室温下摇床中充分吸附24 h，而后离心，用HPLC法分别测定上清液中10-DAB、巴卡亭Ⅲ、紫杉醇的质量浓度，并计算吸附量。

1.4 表征分析

1.4.110-DAB-MINs表征 采用SEM分析10-DAB-MINs的表面形貌；采用激光粒度分析仪分析材料的粒径；采用全自动比表面积及孔径分布测定仪对10-DAB-MINs的孔径进行分析；采用FT-IR仪分析材料的官能团，扫描波数范围为4 000～400 cm-1；采用TG分析仪分析样品的热稳定性，温度范围为0～800 ℃。

1.4.2HPLC分析 RP-HPLC分析采用Agilent Technologies 1260高效液相色谱系统，配有标准手动进样器、四元泵、恒温柱室(TCC)和可变波长扫描紫外检测器(VWD)。采用C18高效液相色谱柱(250 mm×4.60 mm, 5 μm, 00G-4012-E0，美国飞诺美)，以乙腈/水(体积比42∶58)为流动相，流速为1.0 mL/min。10-DAB的检测波长设为234 nm。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹聚合物制备条件筛选

2.1.1功能单体的种类 功能单体与模板分子之间形成的弱作用力强度会影响选择性吸附性能，因此功能单体的种类和用量会影响10-DAB-MINs的吸附能力，需要对功能单体的种类及用量进行筛选。分别探讨了MAA、AM及4-VP这3种功能单体对10-DAB-MINs吸附量的影响，结果见表1。从表1可以看出，以4-VP为功能单体制备的分子印迹聚合物对10-DAB的吸附量达到27.41 mg/g，大于以MAA和AM为功能单体制备的分子印迹聚合物的吸附量，因此选择4-VP为最优的功能单体。

表1 分子印迹聚合物10-DAB-MINs制备条件筛选

2.1.2模板分子和功能单体的比例 为了进一步确定聚合物制备的最佳条件，选择模板分子与4-VP按不同的物质的量比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10)进行反应，结果如表1所示，发现当10-DAB 与4-VP物质的量比为1∶10 时，吸附量最大，达到27.41 mg/g。

2.1.3模板分子与交联剂的比例 对模板分子与交联剂EGDMA比例进行优化，结果如表1所示。随着EGDMA的增加,分子印迹聚合物的吸附量呈现先增加后减少的趋势。当10-DAB与EGDMA的物质的量比为1∶30时，吸附量最高，达到27.42 mg/g。当EGDMA用量继续增加吸附量却下降，可能是10-DAB-MINs表面形成了冗余接枝，这极大地影响后续洗脱和吸附实验的结果。因此，选择10-DAB与EGDMA的最优物质的量比为1∶30。

2.1.4聚合温度 在合成反应过程中保持参与反应的物质质量与反应条件不变，在3种不同的温度(50、60和70 ℃)下进行10-DAB-MINs的制备，对制备出的10-DAB-MINs的吸附量进行比较选择出最佳的温度。由表1可以看出，当温度为60 ℃时，吸附量最大，由于起始加入10-DAB的量相同，聚合度在此温度下也达到最大，为69.63%。

2.2 材料表征

a.10-DAB; b.10-DAB-MINs; c.NINs

2.2.2SEM分析 用扫描电镜对制备的10-DAB-MINs和NINs进行表征,结果见图2。由图可知，10-DAB-MIN和NINs均呈现均匀的球形结构。通过对比可以发现，在放大倍数相同时，10-DAB-MINs相较NINs表面更粗糙。这是因为聚合物10-DAB-MINs表面成功形成了模板分子10-DAB的识别空穴，由此可以说明10-DAB-MINs被成功制备。

a.10-DAB-MINs,×10 000; b.10-DAB-MINs,×30 000; c.10-DAB-MINs,×50 000;d.NINs,×10 000; e.NINs,×30 000; f.NINs,×50 000

2.2.3粒径分析 对10-DAB-MINs和NINs进行粒径分析，由图3可以看出10-DAB-MINs和NINs均是纳米级别的粒子，10-DAB-MINs粒子的粒径主要分布在347.5～355 nm之间，NINs粒子的粒径主要分布在318～324 nm之间，这可能是10-DAB-MINs制备过程中添加模板分子10-DAB形成了特异性识别空腔，导致粒径较大。

图3 10-DAB-MINs(a)和NINs(b)的粒径分布

2.2.4孔径分布分析 根据孔径分布曲线图4可以看出，10-DAB-MINs以1.5 nm左右的微孔为主，NINs则以1.7 nm左右的微孔为主，两者的平均孔径分别为8.54和7.06 nm。10-DAB-MINs与NINs的比表面积分别为 0.66和0.64 m2/g，孔容分别为1.86×10-3和1.32×10-3cm3/g。10-DAB-MINs的比表面积大于NINs，出现这一结果的原因可能是10-DAB-MINs聚合物内部形成了NINs内部结构中没有的印迹孔穴。

图4 孔径分布

2.2.5TG分析 图5为10-DAB-MINs与NINs在温度为50～800 ℃范围内的TG曲线。

图5 材料的热重曲线

由图5可知，在温度为50～300 ℃时，两种材料都有轻微的质量损失，这可能是材料表面水分的蒸发以及交联剂和功能单体的分解；300～400 ℃时，两种材料的质量损失速率明显加快，这是由于材料表面的聚合物层的分解所导致的，这一现象说明成功合成了10-DAB-MINs和NINs。通过对比10-DAB-MINs和NINs两条曲线可以看出，NINs在410 ℃时失去大部分质量，几乎完全分解，而10-DAB-MINs失去大部分质量的温度在430 ℃左右，10-DAB-MINs的分解温度高于NINs，这说明合成的10-DAB-MINs化学键结合牢固，热稳定性强。

2.3 动力学吸附曲线

为了探讨10-DAB-MINs(NINs)的吸附特性，使用准一级和准二级动力学模型进行拟合，如图6所示，10-DAB-MINs(NINs)的吸附量随时间的增加而增加。通过计算得到两种模型所对应的相关参数如表2所示。对比可知，10-DAB-MINs使用准一级和准二级模型拟合出的R2值相当，但是准二级动力学模型进行拟合后所得到的R2要略大，表明10-DAB-MINs不仅存在化学吸附，也存在非特异性的物理吸附。这是由于10-DAB-MINs具备的立体空腔和结合位点上的特定分子识别作用，以及随机分布在表面上的官能团的共同吸附所致。NINs使用准一级模型拟合出的R2较大，这是由于NINs表面缺乏足够的特异性空腔，化学吸附不足，以非特异性的物理吸附为主。然而10-DAB-MINs的准二级平衡吸附量大于准一级平衡吸附量，由此表明10-DAB-MINs以化学吸附为主。

图6 动力学吸附曲线 图7 Langmuir、Freundlich(a)及Langmuir-Freundlich(b)等温吸附曲线

表2 动力学吸附参数

2.4 等温吸附曲线

对10-DAB-MINs(NINs)的吸附过程进行吸附等温线探究，根据不同质量浓度的10-DAB甲醇溶液对聚合物吸附量的影响绘制了10-DAB-MINs(NINs)的吸附等温曲线，如图7所示。从图7可以看出，随着10-DAB甲醇溶液质量浓度的增加，10-DAB-MINs和NINs的吸附量均出现上升趋势，且10-DAB-MINs吸附量均大于NINs。

Langmuir是一个单分子层的均匀吸附模型，Freundlich通常用来描述非均匀吸附模型，所以Langmuir和Freundlich吸附等温线模型均不足以描述实际的吸附模型。为了弥补这一不足，同时采用Langmuir-Freundlich吸附等温线模型对实验数据进行拟合，结果如表3所示。

由表3中相关系数R2可以看出 Langmuir和Freundlich吸附等温线模型对数据的拟合结果相近，均小于Langmuir-Freundlich吸附等温线模型拟合的结果R2(0.982 7)，说明该吸附过程的机理更符合Langmuir-Freundlich吸附等温线模型。这可能是由于在该吸附条件下，除了10-DAB-MINs的印迹孔穴对10-DAB分子产生了均匀的单分子层吸附，印迹分子的表面与10-DAB之间存在的非化学键力也可能引发部分多相吸附表面的吸附平衡。因此，10-DAB-MINs符合Langmuir-Freundlich吸附等温线模型。

表3 等温吸附拟合参数

2.5 循环利用性

如图8所示，经过5次循环实验，每次循环后10-DAB-MINs的吸附量都高于NINs。循环使用时10-DAB-MINs吸附量和解吸附量保持稳定，吸附量最高可达31.42 mg/g，说明10-DAB-MINs吸附能力强且有良好的可重复利用性。在经历了5次吸附-解吸循环后10-DAB-MINs仍然保持着28.66 mg/g 的吸附量，表明10-DAB-MINs具有良好的可重复利用性。

图8 10-DAB-MINs和NINs的重复利用性能

2.6 选择吸附性

为了更好地探究10-DAB-MINs的特异性吸附能力，选择了两种质量浓度相同(0.1 g/L)的与10-DAB结构相似物质的溶液作为干扰物质(如图9)，对10-DAB-MINs(NINs)在单元体系中对目标化合物10-DAB(a)及两种干扰物质巴卡亭Ⅲ(b)、紫杉醇(c)的吸附能力进行了比较。吸附结果如表4所示，由表中可以看出，10-DAB-MINs对10-DAB有明显的选择性吸附能力，吸附量达37.08 mg/g。可见10-DAB-MINs对10-DAB有优异的选择吸附性。

表4 10-DAB-MINs的选择性吸附能力

图9 10-DAB(a)、巴卡亭Ⅲ(b)和紫杉醇(c)结构式

3 结 论

3.1以10-DAB为模板成功制备了可高效选择性识别10-DAB的分子印迹纳米微球。对样品进行了一系列表征，证明10-DAB-MINs成功合成，且稳定性良好。采用最佳制备条件，利用沉淀聚合法所制得的10-DAB-MINs对10-DAB具有较高的吸附能力，吸附量达到37.42 mg/g。

3.2吸附动力学和吸附等温线实验表明10-DAB-MINs的吸附动力学过程符合准二级动力学模型，吸附平衡过程符合Langmuir-Freundlich吸附等温线模型。此外，循环吸附实验表明：该10-DAB-MINs在进行5次循环吸附后对10-DAB仍有良好的吸附量，该材料有良好的重复利用性。