漆酚酯键合SiO2色谱柱分离纯化天麻素及其热力学研究

曾 磊，易冯梅，曹 宇，史伯安,, 雷福厚*

(1.广西民族大学 化学化工学院；广西林产化学与工程重点实验室；林产化学与工程国家民委重点实验室；广西林产化学与工程协同创新中心，广西 南宁 530006；2.湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

天麻为兰科植物天麻的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，是中医用于治疗小儿惊风、癫痫、肢体麻木、风湿痹痛、头痛等病症的常用药物[1]。天麻素(GAS)是天麻的有效活性成分之一，化学名称为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，又名天麻苷。由于该化合物是一种良好的钙离子通道阻滞剂，在临床上常用于治疗神经系统[2-4]和心脑血管方面疾病[5-6]。随着天麻素研究的不断深入，新的药用价值也不断被开发出来，如抑制肝细胞凋亡、改善肝脏病例变化[7]，抑制人视网膜内皮细胞损伤[8]，对骨关节炎[9]和骨质疏松症[10]具有治疗作用，因而具有广阔的开发应用前景。目前许多天麻药品和制品直接以天麻全品生产，这不利于控制产品质量[11]。因此，对天麻产品的开发需要向深加工和精制方面发展，实现其高质化利用、提升其附加值[12]。天麻素提取效率的提高对天麻药物的生产和研发具有重要的意义。高效液相色谱(HPLC)法作为一种高效、快速、检测灵敏、条件温和的分离方法具有广泛的适用性[13]。在液相色谱(LC)中，色谱柱作为色谱系统的核心部件对物质的分离起到关键性的作用[14]。除此之外，色谱分离条件同样也会对色谱柱的分离性能造成影响，例如流动相、检测波长、柱温等因素[15]。本研究利用自制的漆酚酯键合SiO2色谱柱对中药天麻的主要活性成分天麻素进行分离纯化，以天麻素的结构类似物苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PGL)和4-甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(MGL)作为竞争分子，考察漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻素的分离性能，并利用 Van’t Hoff 方程对其分离过程的热力学进行研究，以期为天麻素的分离纯化提供一种新的思路。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

天麻(GastrodiaelataBl.)干样，湖北恩施。磷酸、无水乙醇和石油醚，分析纯；尿嘧啶、天麻素(GAS)、苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PGL)和4-甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(MGL)，均为分析标准品(HPLC，≥98%)，阿拉丁试剂公司；乙腈，色谱纯；超纯水为实验室自制。

漆酚酯键合SiO2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，实验室自制[16]；WR5-3838 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，LC-15C高效液相色谱(HPLC)仪，LC-20AR制备型HPLC仪，日本岛津公司。

1.2 标准品溶液的配置

分别准确称取天麻素及其结构类似物(结构式见图1)5.0 mg，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(体积比3∶97，下同)溶解，配置成0.5 g/L的标准品溶液。分别量取1 mL的3种标准品溶液，混合后定容至10 mL，放置冰箱保存备用。

图1 天麻素及其衍生物结构式

1.3 天麻粗提物的制备

将天麻干样粉碎后过0.15 mm筛网，并在50 ℃条件下真空干燥8 h。称取50 g天麻粉末，在70 ℃的温度下，用200 mL 60%乙醇溶液提取3次，每次2 h，抽滤除掉滤渣，合并3次粗提液，用石油醚萃取脱脂后旋蒸浓缩，制得天麻粗提物。取天麻粗提物15.0 mg，用流动相溶液定容至50 mL，配置的溶液经微孔滤膜过滤后，得到天麻粗提物溶液。

1.4 天麻素的纯化

将漆酚酯键合SiO2色谱柱接入LC-20AR高效液相色谱仪中，在以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相、检测波长220 nm、流速0.4 mL/min、进样量20 μL、柱温25 ℃的色谱条件下进行分离纯化。通过馏分收集器收集天麻素的馏分，将馏分浓缩后用C18柱检测其纯化效果(流速为1.0 mL/min，其他色谱条件同漆酚酯键合SiO2色谱柱)。

1.5 热力学研究

为了探究天麻素及其结构类似物在漆酚酯键合SiO2色谱柱上的分离机理，研究了25～45 ℃范围内漆酚酯键合SiO2色谱柱分离天麻素及其结构类似物的热力学行为。通过Van’t Hoff方程计算热力学参数[17-19]，计算公式见式(1)和(2)：

(1)

(2)

式中：k—溶质的保留因子；α—相邻两种物质之间的分离因子；R—气体常数，8.314 J/(mol·K)；T—柱温，K；ΔH—溶质在固定相和流动相之间分配的焓变值，kJ/mol；ΔS—溶质在固定相和流动相之间分配的熵变值,J/(mol·K)；ΔΔH—待分离组分在固定相和流动相之间分配的焓变的差值,kJ/mol；ΔΔS—待分离组分在固定相和流动相之间分配的熵变的差值,J/(mol·K)；φ—相比，即固定相与流动相的体积比值(Vs/Vm)。

2 结果与讨论

2.1 漆酚酯键合SiO2色谱柱的分离性能

由于漆酚酯键合SiO2色谱柱与C18柱同为反相色谱柱，并且具有烷基疏水长侧链，所以在流动相的选择上参考了药典[1]的方法。以乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相，磷酸起到调节色谱峰峰型的作用，乙腈起到调节流动相的洗脱能力。在流速为1.0 mL/min、进样量为20 μL、柱温为25 ℃和检测波长为220 nm条件下，其分离色谱图见图2，PGL-GAS的分离度为6.09；MGL-GAS的分离度为10.95，表明在该色谱条件下漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻素及其结构类似物表现出良好的分离性能。

2.2 色谱条件对漆酚酯键合SiO2色谱柱分离性能的影响

2.2.1柱温 以乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相，在流速0.4 mL/min的条件下，考察了柱温对色谱柱分离性能的影响，结果见图3。

图3 柱温对天麻素及其结构类似物分离度的影响

由图可知，随着柱温的升高，漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻素及其结构类似物的保留能力有所减弱。从动力学角度分析，温度的升高会降低流动相的黏度，导致传质阻力下降，提升柱效，有利于分离。从热力学角度分析，较高的温度削弱了溶质与固定相之间的作用力，导致溶质的保留时间和保留因子降低，不利于分离[18]。由实验结果可知，在分离过程中随着柱温升高，分析物的保留因子与分离度均有所下降，表明温度对漆酚酯键合SiO2色谱柱分离选择性的影响强于其对色谱柱柱效的影响[19]，因此选择25 ℃作为分离柱温。

2.2.2流速 由于流速较大洗脱能力较强，削弱了天麻素及其竞争分子与固定相之间的作用力，所以固定相对天麻素及其结构类似物的保留能力较弱，导致出峰时间较早。考虑到天麻粗提物中存在许多杂质和其他物质，过早出峰不利于其分离和纯化。为了优化天麻素的出峰时间，通过调节流速来调控天麻素的出峰时间。在柱温为25 ℃条件下，流速对天麻素及其结构类似物分离度的影响结果见图4(a)。

由图可知，随着流速的降低，天麻素与两组竞争分子的分离度逐渐升高，流速为0.4 mL/min时分离度最大，其色谱分离图如图4(b)所示。当流速降到0.3 mL/min时，分离度有所降低。这是由于洗脱能力下降后，分子扩散较为严重，色谱峰峰型变宽从而导致分离度下降。通过降低流速可以调整出峰时间，当流速降为0.4 mL/min时分离度最大且峰型未发生明显的改变，因此选择0.4 mL/min作为分离流速。此时，色谱柱对PGL-GAS和MGL-GAS的分离度分别达到7.8和14.0。

图4 流速对天麻素及其结构类似物分离度的影响(a)及其在0.4 mL/min时的分离色谱(b)

2.3 漆酚酯键合SiO2色谱柱分离纯化天麻素

2.3.1分离纯化效果分析 以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，柱温25 ℃，进样量20 μL，检测波长220 nm，流速为0.4 mL/min的色谱条件下，测试漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻粗提物的分离性能，结果见图5(a)。

1.粗提物crude extract; 2.标准品standard

由图可知，天麻粗提物经漆酚酯键合SiO2色谱柱分离后，出现5个特征色谱峰，其中响应值最强的色谱峰与天麻素标准品的色谱峰保留时间一致。可以看出，漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻粗提物表现出良好的分离性能，为后续对天麻素的纯化奠定了基础。将流速调至1.0 mL/min，其他条件不变，测试C18柱对天麻粗提物的分离性能，结果见图5(b)。由图可知，经C18柱分离后出现2个特征峰，其中响应值最强的色谱峰与天麻素对照品的色谱峰保留时间一致。通过面积归一化法计算得到粗提物中天麻素的纯度为17.06%，表明天麻粗提物中除天麻素外还存在大量的杂质。

天麻粗提物经漆酚酯键合SiO2色谱柱重复进样30次，收集天麻素段的馏分。将收集到的馏分进行浓缩，再用流动相溶液溶解，经微孔滤膜过滤后得到天麻素纯化溶液。将天麻素纯化溶液用C18柱进行检测，结果见图6。由图可知，天麻素粗提物经过漆酚酯键合SiO2色谱柱纯化后，杂质含量明显降低，通过面积归一化法计算得到天麻素的纯度为93.45%，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对天麻素具有较好的纯化效果。这为天麻素的纯化提供了新的思路。在后期工作中课题组会将漆酚酯键合SiO2固定相用于制备柱填料，并将其应用于天麻素的分离纯化。

图6 纯化天麻素在C18柱的色谱

2.3.2稳定性评价 在实际应用过程中，色谱柱需要具有良好的稳定性。为了评价漆酚酯键合SiO2色谱柱的稳定性，随机选取6次天麻粗提物的分离色谱图，叠加后如图7所示，由图可知，色谱峰基本可以重叠。对各色谱峰的保留时间和峰面积分别进行统计，其中保留时间的RSD≤0.39%，色谱峰峰面积的RSD≤2.64%，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱具有良好的稳定性。

2.4 分离天麻素及其结构类似物的热力学研究

2.4.1分离GAS与PGL的热力学研究 根据Van’t Hoff方程对PGL和GAS的lnk-1/T和lnα-1/T进行线性拟合得到热力学方程，结果见表1。在25～45 ℃范围内拟合所得到的热力学方程均表现出良好的线性关系，表明在该温度范围内漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS和PGL的保留机制未随温度改变发生变化。随着柱温升高，GAS和PGL的保留因子与分离度均有所下降，表明柱温对漆酚酯键合SiO2色谱柱分离选择性的影响强于其对色谱柱柱效的影响[19]。

表1 GAS和PGL/MGL在漆酚酯键合SiO2色谱柱的热力学参数(298K)

根据热力学方程计算得到的热力学参数如表1所示。GAS与PGL的ΔH均小于0，表明GAS和PGL在固定相的保留过程均为放热过程。|ΔHGAS|<|ΔHPGL|，表明PGL与固定相之间的作用力强于GAS，所以GAS较PGL在色谱柱上先被洗脱出来。GAS和PGL的ΔS均小于0，并且|ΔSGAS|>|ΔSPGL|，表明GAS和PGL在经过固定相与流动相两相之间的分配作用后，有序性增强，并且GAS在漆酚酯键合SiO2色谱柱上的分子总体有序性更强；ΔGGAS>0，ΔGPGL<0，表明分离过程中GAS在固定相上的保留是一个非自发过程，而PGL是一个自发过程；ΔΔG<0，ΔΔH<0，ΔΔS>0，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS和PGL的分离过程为一个自发过程，该过程既受焓驱动又受熵驱动。

2.4.2分离GAS与MGL的热力学研究 根据Van’t Hoff方程对MGL和GAS的lnk-1/T和lnα-1/T进行线性拟合得到热力学方程，结果亦见表1，在25～45 ℃范围内拟合所得到的热力学方程均表现出良好的线性关系，表明在该温度范围内漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS和MGL的保留机制未随温度改变发生变化。随着柱温升高，GAS和MGL的保留因子与分离度均有所下降，表明柱温对漆酚酯键合SiO2色谱柱分离选择性的影响强于其对色谱柱柱效的影响[19]。

漆酚酯键合SiO2色谱柱分离GAS和MGL的热力学数据如表1所示。GAS与MGL的ΔH均小于0，表明GAS和MGL在固定相的保留过程均为放热过程。因此当柱温升高时，固定相对GAS和MGL的保留能力减弱，分离度降低；|ΔHGAS|<|ΔHMGL|，表明MGL与固定相之间的作用力强于GAS，所以GAS较MGL在漆酚酯键合SiO2色谱柱上先被洗脱出来；ΔS小于0，并且|ΔSGAS|>|ΔSMGL|，表明GAS和MGL在经过固定相与流动相两相之间的分配作用后，有序性增强，并且GAS在漆酚酯键合SiO2色谱柱上的分子总体有序性更强；ΔGGAS>0，ΔGMGL<0，表明分离过程中GAS在固定相上的保留是一个非自发过程，而MGL是一个自发过程。

ΔΔG<0，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS和MGL的分离过程为自发过程。ΔΔH<0，ΔΔS>0，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS和PGL的分离过程既受焓驱动又受熵驱动。结合表1中数据可以看出，|ΔΔGMGL-GAS|>|ΔΔGPGL-GAS|，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对MGL-GAS的分离能力大于PGL-GAS，这也与实际分离情况相符合。

3 结 论

3.1以天麻素(GAS)的结构类似物PGL和MGL作为竞争分子，确定了漆酚酯键合SiO2色谱柱分离GAS的最佳色谱条件：乙腈/0.05%磷酸水溶液(体积比3∶97)为流动相，柱温25 ℃，检测波长220 nm，流速0.4 mL/min。在该色谱条件下，漆酚酯键合SiO2色谱柱对PGL-GAS的分离度达到7.8，对MGL-GAS的分离度达到14.0。

3.2通过Van’t Hoff方程对PGL-GAS和MGL-GAS的分离过程进行热力学研究，发现二者的规律一样，分离过程中ΔΔH<0、ΔΔS>0、ΔΔG<0，表明漆酚酯键合SiO2色谱柱对GAS及其结构类似物的分离过程是一个自发的放热过程，该分离过程既受熵驱动又受焓驱动；随着柱温的升高，保留因子和分离度均有所降低。

3.3将天麻粗提物用漆酚酯键合SiO2色谱柱进行分离纯化，纯化后GAS的杂质明显降低，其纯度由粗提物的17.06%提升至93.45%。该研究既为分离纯化GAS提供了一种思路，还拓展了漆酚酯键合SiO2色谱柱在实际分离方面的应用。