表现为急性不明原因发热的疑似恙虫病患者临床特征及病原学分析（8例）

周海慧 林金 奚娜 周继恩 陈序伟 王其泰 徐苗燕 陈景丹 杨章女

1浙江省三门县疾病预防控制中心检验科，台州 317100；2浙江省三门县疾病预防控制中心传染病防治科，台州 317100；3浙江省三门县人民医院感染科，台州 317100；4浙江省疾病预防控制中心微生物所，杭州 310051

临床诊疗中以发热为首发症状就诊的患者很多，其病因复杂多样，是临床上面临的挑战。感染是发热的主要病因，致病原包括细菌、病毒、真菌、放线菌、支原体、衣原体、螺旋体和立克次体。本研究对浙江省三门县部分不明原因发热患者进行血清学和分子生物学检测，探索其病因并分析基因型。

对象与方法

一、患者和样本采集

将2021年4—11月三门县人民医院接诊的，经常规检查无法明确病因的8例急性发热患者纳入研究。临床医生结合流行病学史，判断为疑似恙虫病，故采集急性期和恢复期血液样本进行恙虫病病原学诊断；同时由于恙虫病和斑点热的临床表现极其相似，因此对所有病例进行斑点热病原学检测。所有病例均对本研究知情同意，研究符合赫尔辛基宣言。

二、立克次体感染检测

患者急性期血液样本进行恙虫病东方体、斑点热群（SFGR）和斑疹伤寒群（TGR）立克次体核酸检测。核酸提取：取200 μL全血，采用Qiagen DNA Blood Mini Kit（QIAGEN,Hilden,Germany）提取全血DNA，按说明书进行。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：采用实时荧光PCR法恙虫病东方体核酸检测试剂盒和立克次体属核酸检测试剂盒(硕世生物科技股份有限公司，江苏)检测恙虫病东方体、SFGR和TGR核酸，按说明书进行。巢式PCR（n-PCR）：参照中国CDC《立克次体病诊断与处置手册》[1]，分别靶向恙虫病东方体和立克次体属groEL基因片段。

三、序列比对和系统发育分析

PCR扩增产物目标条带测序由擎科生物技术有限公司进行。获得的核苷酸序列进行BLAST比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），初步确定病原学分类地位。从Genbank中检索相关groES基因序列，选择部分在中国和亚太地区具有代表性的基因型序列。应用MEGA7.0（https://www.megasoftware.net/）软件，进行系统发育分析。

四、间接免疫荧光（IFA）

按照国家CDC《立克次体病诊断与处置手册》进行[1]，恙虫病和斑点热特异性抗原片由浙江省CDC微生物所提供，抗人IgG荧光抗体购自Sigma公司，患者血清1∶16起倍比稀释，以≥1∶32为阳性参考值，双份血清4倍及以上增高或单份血清≥1∶512认为现症感染。

结 果

一、一般资料

8例不明原因发热患者中，男性7例，女性1例（病例6）；职业均为农民；发病前2周内均有上山或灌木草丛等野外活动史；5例患者有特异性焦痂和/或皮疹，其中2例有淋巴结肿大，伴有轻度肝损害。病例4为重症患者，发热，咳嗽，无痰，活动时胸闷气促，伴有肺炎、胸腔积液、肝肾功能不全和凝血功能异常等并发症。

二、实验室检查结果

8例患者实验室检测结果见表1，共计5例患者实验室确认为恙虫病东方体感染。病例4在病程第2天时，WBC 2.6×109/L，中性粒细胞90%，血小板19×109/L，ALT 86 U/L，AST 182 U/L，碱性磷酸酶253 U/L，γ-谷氨酰转肽酶213U/L，总胆红素84.8 μmol/L,直接胆红素55.3 μmol/L，总蛋白46.2 g/L，白蛋白24.4 g/L，球蛋白21.8 g/L，血肌酐370 μmol/L，尿素23.22 μmol/L。该病例的凝血功能常规检查+D-二聚体(DD)结果显示，病程第5天：凝血酶原国际标准化比值为1.18，活化部分凝血活酶时间(APTT)59.5 s，DD18.59 mg/L；病程第9天：纤维蛋白原(FIB)1.47 g/L，纤维蛋白降解产物(FDP)6 633 μg/L；病程第10天：血肌酐417 μmol/L，尿素29.70 μmol/L，血尿酸491 μmol/L。

表1 8例急性不明原因发热疑似恙虫病患者的部分实验室检测结果

三、影像学检查

病例4在病程第4天时，CT平扫结果显示，慢性支气管炎，肺气肿，两肺散在感染，两侧少量胸腔积液，两侧腋窝多发淋巴结肿大；颈部彩超探及双侧淋巴结。在病程第9天时，慢性支气管炎，肺气肿，两肺炎症及肺水肿，两肺胸腔积液伴两肺下叶部分萎缩，两肺散在纤维增生灶，右肺中叶肺气囊，纵膈及两侧腋窝数枚淋巴结肿大。其他病例肺部影像学无明显改变。

四、核酸检测结果

3例患者急性期血液RT-qPCR法恙虫病东方体核酸阳性，他们的Ct值均≤30.98，其中2份的n-PCR结果扩增到约360 bp核酸片段（图1）。所有样本RT-PCR和n-PCR均未检测到立克次体属核酸。

2份n-PCR核酸阳性扩增产物的DNA片段测序，获得其365 bp的核苷酸序列，分别是Fang/2021（病例6）和Jing/2021（病例7）。BLAST比对2份样本均属恙虫病东方体，应用MEGA7.0软件，构建了2条序列和中国及亚太地区部分相关基因型序列的系统发育树（图1）。2条序列在系统发育树拓扑结构的不同支系，表明2例患者感染了不同基因型的恙虫病东方体，Fang/2021与Karp原型株有一个碱基的差异（2次核酸提取，PCR扩增测序结果相同），属于无义突变；Jing/2021与浙江-2型Liu/2011[2]一致性为100%。

图1 364 bp恙虫病东方体groEL基因序列系统发育树

五、病原学诊断

3例急性期恙虫病东方体核酸阳性患者，其中2例同时采集到恢复期血清，双份血清抗恙虫病IgG抗体滴度4倍以上增高；另有2例急性期恙虫病东方体核酸阴性患者，其中1例双份血清抗恙虫病IgG抗体滴度4倍以上增高，1例单份滴度血清≥1∶512。IFA检测抗恙虫病IgG抗体结果表明，病例5病程第4天滴度达1∶512，其余病例1～5 d阴性或在临界值；4例患者采集到恢复期血清，其中3例抗恙虫病IgG抗体滴度≥1∶1 024。所有血清抗斑点热抗体阴性。其余3例未得到恙虫病东方体感染确认的病例，病例1和病例2诊断为急性上呼吸道感染，病例8为不明原因感染性发热。

六、治疗

8例患者中，5例患者为恙虫病，其中4例轻型，1例重症。4例轻型恙虫病患者经口服多西环素肠溶胶囊及其他对症治疗痊愈。1例重症恙虫病患者经多西环素肠溶胶囊和特治星抗感染治疗，基本痊愈。其余3例病例经抗感染治疗后均治愈出院。

讨 论

本研究对流行季节并有野外活动史的急性发热患者进行了恙虫病东方体和斑点热立克次体的核酸和特异性抗体检测，病原学确认三门地区存在散发恙虫病东方体感染。我国为恙虫病重点疫区之一，2006—2016年，国家疾病监测系统共记录93 481例恙虫病病例，总体实验室确诊比例仅为4.7%[2-3]。国内立克次体病常见致病原为恙虫病东方体和斑点热立克次体，分别引起恙虫病和斑点热，都以高热、皮疹、特征性焦痂、淋巴结肿大为典型临床特征，仅依据临床表现难以鉴别[4]。

8例发热并有野外活动史患者中，5例恙虫病确诊患者有特异性焦痂和/或皮疹，其中1例仅有皮疹，如果不进行病原学检测，很容易漏诊。恙虫病东方体感染可引起多种并发症，其中并发肺炎和胸腔积液报道较多[5-6]，本研究1例恙虫病重症患者并发肺炎、胸腔积液和凝血功能异常，其胸部CT影像与其它感染引起的肺炎无特征性差别。多西环素和哌拉西林钠/他唑巴坦钠抗感染治疗有效。恙虫病治疗有特效敏感的抗菌素，但早期临床症状不典型，易造成误诊和漏诊，导致病情加重。因此，精确和快速的病原学诊断对于恙虫病的确诊和治疗具有非常重要的意义。

本研究检测到恙虫病东方体核酸，序列分析表明为不同基因型，分别为Karp相关和Liu/2011相关，但由于获得序列较短，还不能确切鉴定基因型。值得注意的是，恙虫病东方体血液样本内载量较低；对四环素类、大环内酯类和喹诺酮类等抗菌素敏感，菌血症维持时间短；常温下样本内恙虫病东方体存活时间短，DNA极易降解，给核酸检测尤其是序列分析带来困难。因此，临床要在发热期、使用有效抗菌素之前尽快采集血液和焦痂样本，低温运输和贮藏，尽快检测。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明周海慧：酝酿和设计实验、实验研究、采集数据、分析解释数据和撰写文章；林金、奚娜、周继恩、陈序委、王其泰、徐苗燕、陈景丹：采集数据；杨章女：指导研究