ω-3鱼油脂肪乳剂通过醛类应激激活Nrf2/HO-1信号通路减轻肺缺血再灌注损伤

张裕坚，刘付丽，董娇娇，叶颖超，林婷婷，蔡瑶瑶，刘 乐

0 引言

肺缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤是一种急性无菌性肺部损伤,涉及机制复杂广泛[1-2]，可形成炎症级联反应[3]、氧化应激[4-5]、内皮细胞屏障损伤[6]、细胞凋亡[7]等一系列病理生理过程，其中氧化应激起着关键作用。醛类物质是脂质过氧化的主要终产物，参与氧化应激，高剂量的醛类物质具有细胞毒性，但是低剂量的醛类物质对机体具有保护作用[8-9]。前期团队研究发现，ω-3鱼油脂肪乳剂(ω-3 fish oil fat emulsion，ω-3FOFE)预处理通过产生低剂量的醛类物质，刺激抗氧化酶的产生，从而减轻心肌I/R损伤[10]。目前尚未见醛类应激在肺I/R损伤中的研究，因此，本项目通过确定ω-3FOFE预处理产生醛类应激的时间，构建大鼠在体肺I/R模型，探讨ω-3FOFE对肺I/R的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年SPF级雄性SD大鼠，体重300～350 g，由温州医科大学实验动物中心提供。原位TUNEL凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠多克隆Nrf2抗体 (美国Abcam公司)，兔抗大鼠多克隆HO-1抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗大鼠单克隆组蛋白H3抗体(美国Millipore公司)，兔抗大鼠单克隆β-actin抗体(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 确定ω-3FOFE预处理产生醛类应激激活抗氧化信号通路时间 ω-3FOFE 注射液剂量参考团队前期报道(2 ml/kg)。选择24只 SD雄性大鼠，随机分成4组(n=6)：NS5组(生理盐水注射液2 ml/kg尾静脉注射5 d)、FO5组(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾静脉注射5 d)、FO3组(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾静脉注射3 d)、FO1组(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾静脉注射1 d)。于末次给药后24 h处死大鼠，取肺组织置于液氮保存。采用相应的试剂盒检测大鼠肺组织MDA和GSH含量；免疫印迹(Western blot，WB)法检测核因子-E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶-1(Heme oxygenase -1,HO-1)蛋白来确定ω-3FOFE预处理产生醛类应激激活抗氧化信号通路时间。本项目医院伦理批件编号：(2021)第(0110)号。

1.2.2 动物分组及构建大鼠肺I/R模型 参考前期团队方法建立大鼠肺I/R模型[11]，选择18只 SD雄性大鼠，随机分为3组(n=6)：Sham组(假手术组)、I/R组(肺缺血再灌注组)、FO组(ω-3FOFE预处理+缺血再灌注组)。Sham组造模前生理盐水注射液2 ml/kg尾静脉注射5 d，造模开胸仅分离左肺动脉和左支气管，不阻断左肺动脉，观察150 min活体取肺；I/R组造模前生理盐水注射液2 ml/kg尾静脉注射5 d，造模开胸阻断左肺门30 min，再开放恢复供血和通气120 min；FO组于造模前ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾静脉注射5 d，其余同I/R组。实验结束处死大鼠，取肺组织置于液氮保存。测定各组湿干重比(Wet/Dry ratio，W/D)；光学显微镜下苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，HE) 染色观察肺组织病理学改变；TdT介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法检测肺组织细胞凋亡情况；试剂盒检测GSH含量；WB检测Nrf2、HO-1蛋白表达。

1.2.3 肺W/D测定 取出右上肺组织，滤纸吸净表面水分后称湿重(Wet，W)，然后置于75 ℃烘箱烘干24 h至恒重，称干重(Dry，D)，两者比值即为肺W/D值。

1.2.4 肺组织病理学改变 取左中肺甲醛固定，脱水透明包埋后制成石蜡切片，HE染色后脱水透明封片，置于光学显微镜下观察肺泡形态、结构改变及肺间质充血水肿等情况。

1.2.5 肺组织细胞凋亡测定 采用TUNEL法检测细胞凋亡，根据试剂盒说明书操作。荧光显微镜下显示为绿色荧光即为凋亡细胞。

1.2.6 MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。按照试剂盒说明书操作上样，在532 nm，1 cm光径检测各管吸光度值并根据说明书公式计算含量。

1.2.7 GSH含量测定 按照GSH检测试剂盒说明书操作上样检测，405 nm处，酶标仪测定各孔吸光度值并根据说明书公式计算含量。

1.2.8 WB检测胞核转录因子Nrf2蛋白 取左肺组织约1 g，提取肺组织核蛋白测定其蛋白浓度，配置10%分离胶，5%浓缩胶，电泳转膜，将蛋白转置聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。配置含5%脱脂奶粉的TBST封闭液，室温封闭1 h，将膜放入相应兔抗大鼠多克隆Nrf2抗体(1∶2 000)、兔抗大鼠单克隆组蛋白H3抗体(1∶2 000)的一抗液中4 ℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔IgG(1∶5 000)的二抗液中室温孵育1 h，TBST洗去抗体液后，加入发光液，用凝胶成像仪显影，系统导出各条带灰度值，以组蛋白H3为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。组间数据比较时，以NS5组或Sham组为对照组，计算其他组与对照组的比值。

1.2.9 WB检测HO-1蛋白 提取肺组织胞浆总蛋白，如上述步骤电泳转膜封闭，将膜放入相应兔抗大鼠多克隆HO-1抗体(1∶200)、兔抗大鼠单克隆β-actin抗体(1∶1 000)的一抗液中4 ℃孵育过夜，后续如上述测定灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。最后组间数据比较时，以NS5组或Sham组为对照组，计算其他组与对照组的比值。

2 结果

2.1 确定ω-3FOFE预处理产生醛类应激激活抗氧化信号通路时间 如表1及图1所示，与NS5组、FO3组和FO1组相比，FO5组大鼠肺组织的醛类物质MDA含量明显增加(P<0.05)，且FO5组的Nrf2/HO-1抗氧化通路蛋白表达和抗氧化酶GSH含量也均明显增加(P<0.05)。NS5组、FO3组、FO1组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，FO5组产生醛类物质发生醛类应激激活抗氧化信号通路，故在后续缺血再灌注实验中，选择ω-3FOFE 2 ml/kg连续注射5 d的预处理。

表1 各组大鼠肺组织MDA、GSH和Nrf2、HO-1蛋白表达量比较(n=6)

图1 WB检测各组大鼠肺组织Nrf2及HO-1蛋白

2.2 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R损伤 在后续实验中，将18只大鼠随机分为Sham组、I/R组和FO组，检测ω-3FOFE 对大鼠肺I/R损伤的影响。如表2所示，与Sham组相比，I/R组的肺W/D显著升高(P<0.05)，在ω-3FOFE预处理后被抑制(P<0.05)。相应地，与Sham组相比，I/R组大部分肺泡被破坏，腔内有大量的红细胞及水肿液聚集，肺间质明显水肿伴大量中性粒细胞浸润；与I/R组相比,FO组肺泡破坏程度明显改善，腔内仅有少量红细胞渗出，如图2所示。此外，通过荧光显微镜检测细胞凋亡情况，结果显示，与Sham组相比，I/R组出现大量凋亡细胞，在ω-3FOFE预处理后被抑制，如图3所示。本实验结果表明，ω-3FOFE预处理抑制了肺W/D的升高，改善肺组织病理损伤和减少细胞凋亡，对肺I/R损伤有保护作用。

2.3 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R过氧化损伤 如表2及图4所示，与Sham组相比，I/R组肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达和GSH含量均显著下降(P<0.05)；与I/R组相比，FO组肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达和GSH含量均显著增加(P<0.05)。结果表明，在大鼠肺I/R模型中，ω-3FOFE预处理后可激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而发挥肺保护作用。

表2 各组大鼠肺组织W/D、GSH含量和Nrf2、HO-1蛋白表达量比较(n=6)

图2 各组大鼠肺HE染色病理图(100×)

图3 各组大鼠肺组织凋亡情况(200×)

图4 WB检测各组大鼠肺组织Nrf2及HO-1蛋白

3 讨论

本研究在大鼠肺I/R模型中检测了ω-3FOFE预处理后对I/R损伤的影响，结果表明，与I/R组相比，FO组大鼠的肺组织W/D下降、肺泡损伤明显改善、细胞凋亡数量大大减少，说明ω-3FOFE对肺I/R损伤有保护作用。这些发现与之前报道ω-3FOFE对不同器官I/R损伤有保护作用一致[10,12-13]，表明ω-3FOFE在预防和治疗肺I/R损伤中具有潜在的临床意义。

ω-3FOFE 中的不饱和双键作为脂质过氧化的靶点可生成醛类物质，而研究表明，低水平的醛类物质对机体存在保护作用。Zhang等[8]报道，在法洛四联症患儿行心脏手术中，体内醛类表达水平较高的一组患儿术后测得肌钙蛋白更低，所需正性肌力药物更少，术后ICU和住院时间更短。MDA是一种醛类物质,是脂质过氧化的主要终产物。GSH有助于保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用。本研究结果显示，注射ω-3FOFE 5 d后，大鼠肺组织中MDA表达水平显著提高，GSH含量显著增加，表明ω-3FOFE预处理5 d会使大鼠产生醛类应激产生抗氧化酶，与Dong等[10]的报道一致。

Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键转录因子，可保护细胞免受氧化应激引起的凋亡[14]。HO-1作为Nrf2下游的靶基因蛋白，是催化血红素降解的重要限速酶，具有抗炎抗氧化的作用[15]。Dong等[10]报道，ω-3FOFE通过激活Nrf2信号通路减轻了心肌的氧化损伤。Sun等[16]在肺I/R实验模型中证明了maresin 1具有保护作用，这种保护部分可能依赖于Nrf2/HO-1信号通路介导的抗氧化应激能力。Fan等[17]报道，激活Nrf2/HO-1通路可减少大脑I/R损伤。Qin等[18]报道，通过上调 HO-1 表达可减少氧化应激从而减轻大鼠的肺缺血再灌注损伤。同样，在本研究中，与I/R组相比，FO组大鼠的肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达显著增加，表明ω-3FOFE激活Nrf2/HO-1通路，与上述报道相符合。

综上所述，本研究首次证明了ω-3FOFE通过醛类应激激活Nrf2/HO-1抗氧化蛋白，从而减轻肺I/R损伤。这为今后的研究和治疗提供了一些思路，但仍需要深入细致的研究来证实。