基于网络药理学和分子对接技术探讨圣愈汤治疗骨关节炎的作用机制

朱在师，赵启刚，李西海

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见、多发、难治的慢性筋骨病，以滑膜炎症、软骨退变、软骨下骨代谢异常为病理特征［1］。OA 属于中医“痹证”“痿证”范畴，OA 患者多因年老体衰、肝肾亏虚，引发气血、筋骨失和，导致发病［2］。针对气血失和是OA 的重要发病机制，临床常用圣愈汤（出自《医宗金鉴·删补名医方论》）调和气血以治疗OA［3-5］。但圣愈汤治疗OA 的活性成分尚未明确，有待进一步研究，因此，本研究借助网络药理学技术和分子对接技术探讨圣愈汤治疗OA 可能的作用机制。

1 方 法

1.1 圣愈汤活性成分、药物靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，筛选圣愈汤中黄芪、人参、熟地黄、白芍、川芎、当归的活性成分，同时在该数据库中检索下载符合要求的活性成分对应的药物靶点。

1.2 OA 差异基因的获取 以“osteoarthritis”为检索词，在GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索OA 相关基因测序表达芯片，将得到的结果按条目类型项目选择“Series”，研究类型项目选择“Expression profilling by array”，物种项目选择“Homo sapiens”进行筛选，筛选后选取差异显著的GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 个 OA 芯片。通过 PERL 软件利用log2 算法，对这3 个OA 芯片进行数据整理，获取3 个芯片中的OA 差异基因。

1.3 活性成分-交集靶点调控网络的构建及分析 利用PERL软件将圣愈汤的药物靶点分别与3个OA 芯片的OA 差异基因取交集，获得3 个OA 芯片与圣愈汤药物靶点的交集靶点，通过R 语言将3 个芯片的交集靶点取并集且去重，获得圣愈汤治疗OA 的交集靶点。将圣愈汤治疗OA 的交集靶点及活性成分导入Cytoscape 3.8.1 软件，绘制圣愈汤活性成分-交集靶点网络图，筛选度值从大到小排序前10 的成分作为圣愈汤治疗OA 的主要活性成分。

1.4 交集靶点蛋白互作网络（PPI）的构建与分析 将交集靶点导入 String 数据库（https：//cn.string-db.org/），将物种设为“Homo Sapiens”，最低阈值设为≥0.4，进行PPI 分析。从String 数据库导出分析所得数据并导入Cytoscape 3.8.1 软件，绘制交集靶点PPI网络图，以中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和节点数目（DC）三者大于各自中位数作为筛选条件，筛选2 次，保留符合条件的交集靶点作为圣愈汤治疗OA 的关键靶点。

1.5 GO 生物学进程与KEGG 通路富集分析 使用R 语言中Bioconductor 插件，对交集靶点进行GO 的生物学过程（bilgical process，BP）、分子功能（mlecular functin，MF）、细胞组分（cell components，CC）以及KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，取矫正后P值排名前10 的生物学功能和排名前20 的信号通路进行分析。

1.6 分子对接验证 利用PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载PPI 网络筛选出的关键靶点的3D 结构，在 PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载关键靶点对应的活性成分结构；用PyMOL 2.4.1 软件移除关键靶点受体结构中的水分子以及小分子配体，然后导入AutoDock Tools 1.5.6软件，使对接位点选择以原有配体为中心，设置网格箱（gird box）为默认值；最后利用AutoDock Vina软件完成圣愈汤关键活性成分与核心靶点的对接，将对接结果输出为txt 文件和pdbqt 文件，通过txt 文件查看两者的最低结合能，用PyMOL 2.4.1打开pdbqt文件查看对接图像；通过关键靶点和活性成分的分子对接结果来验证网络药理学筛选结果。

2 结 果

2.1 圣愈汤活性成分及药物靶点 共筛选出圣愈汤56 个活性成分，其中共有6 个重复活性成分，其余活性成分及靶点数量，见表1。

表1 圣愈汤活性成分及药物靶点基本信息

2.2 OA 差异基因 在 GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 个 OA 芯片中，分别有 1 770、2 342、4 532 个OA 差异基因。

2.3 活性成分-交集靶点调控网络的构建及分析 得到3 个芯片的26、39、54 个交集靶点，将3 芯片的交集靶点取并集且去重，获得圣愈汤治疗OA的98 个交集靶点。构建活性成分-交集靶点网络图，见图1。筛选DC 值前10 的活性成分，见表2。

图1 活性成分-交集靶点网络图

表2 圣愈汤主要活性成分相关信息

2.4 PPI 的构建与分析 构建交集靶点PPI 网络图，见图2。筛选2 次并绘制新的PPI 网络图，筛选流程图见图3。排名前10 的关键靶点信息见表3。

图2 交集靶点PPI 网络图

图3 关键交集靶点筛选流程图

表3 排名前10 的关键靶点信息

2.5 GO 与 KEGG 富集分析 GO 富集分析结果见图4。结果显示BP、MF、CC 主要富集于血管新生的调节、调节缺氧环境、促进炎症反应对脂多糖等生物过程和氧化还原酶活性等分子功能上。KEGG富集结果，见图5，结果显示排名前20通路主要富集在IL-17、TNF、Toll 样受体通路等进程上。

图4 GO 富集分析结果气泡图

图5 KEGG 富集分析结果

2.6 分子对接验证 为进一步验证圣愈汤治疗OA 网络预测结果，选取排名前3 的核心靶点与其对应活性成分做分子对接验证，获得活性成分与核心靶点分子对接自由能，见表4。结合自由能＜0 kcal/mol说明配体和受体可以自发结合，一般认为两者结合自由能越低，发生作用的可能性越大。圣愈汤活性成分与核心靶点结合能均≤-5.0 kcal/mol，提示筛选出的核心靶点与其对应的活性成分具有良好的亲和力。分子对接结果，见图6。

图6 核心靶点分子与槲皮素对接结果展示

表4 核心靶点结合化合物的结合能

3 讨 论

OA 归属中医“痹证”范畴，中医学认为OA 病在筋骨，病位在肝、肾，以气血失和为重要发病机制。肝主筋藏血，肾主骨藏精。若肝肾亏虚，气血失和，则发为痹证，故治疗OA 以调气血、荣筋骨为治则［6］。圣愈汤出自《医宗金鉴·删补名医方论》，由黄芪、人参、熟地黄、白芍、川芎、当归组成，具有益气、摄血、补血之功效。

本研究通过网络药理学探析圣愈汤治疗OA的潜在作用机制。研究结果显示：圣愈汤药物中共有56 个活性成分，集中在黄芪、人参2 味中药，槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇能匹配到较多的疾病靶点。槲皮素作为一种常见的黄酮类化合物，主要功能为抗氧化、抗炎及免疫，保护软骨［7］；槲皮素还可通过p38 信号通路抑制巨噬细胞释放促炎因子，并介导NF-κB 信号通路抑制炎症反应［8］。山柰酚能增加成骨细胞活化因子RUNX-2、Osterix、BMP2、RHCgⅠ表达［9］，通过抗炎、抗氧化，改善 OA病理变化。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫调节等方面有一定的作用，可通过调节TNF-α、IL-6、MMP-13相关信号通路，抑制炎症反应，保护软骨［10］。异鼠李素可抑制破骨细胞活性和软骨细胞凋亡，从而避免软骨损伤，以达到治疗OA 的目的［11］。

PPI 分析结果提示白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、基因金属蛋白酶-9（MMP-9）、原癌基因（MYC）、转录因子AP-1（JUN）、环加氧酶 2（PTGS2）、缺氧诱导因子 1 亚基α（HIF-1α）、过氧化物酶体增生激活受体（PPARG）、热休克蛋白90α 家族A 类成员1（HSP90AA1）、细胞周期蛋白D1（CCND1）是圣愈汤治疗OA 的关键靶点。炎症因子IL-6 受体在软骨细胞中表达，在软骨退变过程中发挥重要的调控作用。MMP-9 通过降解软骨基质，引发软骨退变，参与 OA 病理进程［12］。VEGFA 是血管内皮细胞生长因子VEGF 中最重要的亚型，其对血管内皮的增殖和分化的影响最大。研究表明，VEGF 的表达变化与滑膜炎症、软骨变性及软骨细胞凋亡等过程密切相关［13］，同时可以促进MMP-1 及MMP-3 的表达，从而导致关节软骨组织破坏［14］。

GO 富集分析结果显示：圣愈汤治疗OA 的生物学过程主要涉及脂多糖反应、血管新生调节、缺氧环境调节、氧化应激反应等，与炎症的形成与发展、血管调节有着密切的联系。KEGG 通路富集结果显示：圣愈汤治疗OA 的信号通路主要有AGERAGE 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、IL-17 信号通路等，集中在炎症反应、血管及细胞凋亡等方面。研究表明AGE-RAGE 可激活促炎因子的分泌，导致关节出现炎症反应，同时可充当炎症细胞因子来激活先天免疫细胞，推动OA 病情的发展［15-16］。LPS 又称内毒素，可以激活 Toll 样受体 4（TLR4），引起炎症反应。TLR4 识别 LPS 后，招募下游信号分子触发一系列的信号级联反应，最终活化NF-κB，诱导促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的表达［17］。IL-17 信号通路的主要功能在于促进炎性因子的释放，能够上调IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎性因子的分泌，进而加重炎症反应，导致软骨出现不可逆转的损伤；IL-17 还能抑制骨形态发生蛋白2诱导的成骨细胞分化参与骨重建的调控［18］。我们推测圣愈汤治疗OA 可能与该通路及调节气血有关，有待进一步认证。

将核心靶蛋白与槲皮素对接后获得的结合能均远小于参考值-5.0 kcal/mol，表明圣愈汤活性成分能与OA 核心靶点受体蛋白稳定结合，并发挥显著作用，基于此得到的网络分析结果可信度较高，参考价值较大。

综上所述，本文揭示圣愈汤的活性成分与OA的靶点基因之间复杂调控网络，提示圣愈汤治疗OA 主要涉及的核心靶点包括IL-6、VEGFA、MMP9、MYC、JUN 等，靶点间作用关系复杂多样，富集到多条通路，涉及了炎症、血管生成、免疫等多个方面。提示圣愈汤可能通过调节炎症反应、血管生成、免疫反应和细胞凋亡等方面治疗OA。为进一步验证网络药理学结果，后续可开展相应基础实验进行验证。