弥漫大B细胞淋巴瘤中细胞分裂周期蛋白6的表达及其临床意义

李园 沈明芳 郭志琴 唐伦 郭晓珺

弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是我国最常见的侵袭性淋巴瘤[1]，不同亚型的淋巴瘤在临床表现及转归等多方面均存在明显异质性。细胞分裂周期蛋白6（cell division cyclin 6，CDC6）主要调节DNA 复制过程中G1期向S 期的起始，是细胞复制及增殖所必需的蛋白质[2]。研究显示，CDC6 在许多肿瘤组织中呈现高表达，但是具体机制尚不明确[3]。本课题组前期研究了CDC6 mRNA 在DLBCL 中的表达及其意义[4]，本次研究检测了DLBCL 组织中CDC6 蛋白的表达情况，并初步探讨其在DLBCL中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012 年1 月1 日至2018 年12 月31 日期间首诊于嘉兴市第一医院经病理组织学确诊的初治原发DLBCL 患者60 例为研究组，其中男性35 例、女性25 例；年龄19～86 岁，平均年龄（64.08±11.56）岁；均符合2008 年淋巴造血组织世界卫生组织分类诊断标准[5]，临床病历及随访资料相对完整；同期取20 例淋巴结反应性增生组织的患者作为对照组，其中男性12 例、女性8 例；年龄15～77 岁，平均年龄（57.55±17.68）岁；两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。本次研究获得医院伦理委员会的批准，且术前书面形式告知患者及家属，并取得知情同意。

1.2 方法 采用免疫组化检测并比较两组CDC6蛋白表达水平，进而分析CDC6 蛋白与DLBCL 临床病理特征及预后的关系。

1.2.1 CDC6 蛋白表达情况检测及结果判定 采用组织切片免疫组织化学染色进行检测。兔抗人CDC6 单克隆抗体（ab109315）购自美国abcam 公司，按步骤予以福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，EnVision 二步法染色。每例切片随机选取5 个高倍视野（×200），计数500 个细胞，参照免疫反应积分法进行评分[6]。阳性百分率分4 级：0 分：阴性；1 分：＜25%；2 分：25%～50%；3 分：＞50%。染色强度分4 级：0 分：不显色；1 分：浅黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色。两分级相加，0～4 分判定为阴性表达，≥5 分判定为阳性表达。

1.2.2 收集DLBCL 患者临床病理特征 临床资料包括：性别、年龄、乳酸脱氢酶、血红蛋白，病理类型根据Hams 分型标准[7]分为生发中心型B 细胞样（germinal center B cell-like，GCB）和非生发中心型B 细胞样（non-germinal center B cell-like，non-GCB），根据Ann Arbor 临床分期标准分为Ⅰ～Ⅳ期，参照中国弥漫大B 细胞淋巴瘤诊断与治疗指南（2013 年版）[8]标准进行国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分。

1.2.3 预后分析 末次随访时间为2020 年1 月12日，随访时间13～92 个月，总生存期（overall survival，OS）定义为从确诊当天至任何原因所致的死亡时间或末次随访时间。无进展生存时间（progress free survival，PFS）定义为从确诊当天至疾病复发、进展或任何原因所致的死亡时间或末次随访时间。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件分析。计量资料以均数±标准差（）表示。组间计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。CDC6 蛋白表达与DLBCL 患者临床病理特征的关系采用单因素分析，通过Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，并采用Log-rank 法进行比较。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CDC6 蛋白的表达情况 研究组的CDC6蛋白的阳性表达率56.67%（34/60）高于对照组25.00%（5/20），差异有统计学意义（χ2=6.02，P＜0.05）。CDC6蛋白表达的免疫组织化学图见封二图2。

由封二图2 可见，CDC6 阳性着色呈棕黄色颗粒状，主要定位在细胞核或细胞质中。

2.2 DLBCL 患者不同临床病理特征的CDC6 蛋白的表达比较见表1

表1 DLBCL患者不同临床病理特征的CDC6蛋白的表达比较/例（%）

由表1 可见，在DLBCL 组织中，non-GCB 亚型患者CDC6 蛋白阳性率明显高于GCB 亚型，差异有统计学意义（χ2=8.74，P＜0.05），不同性别、年龄、乳酸脱氢酶、血红蛋白、疾病分期、IPI 评分及原发部位的CDC6 蛋白阳性率比较，差异均无统计学意义（χ2分别=2.24、1.56、0.13、1.07、0.35、0.09、0.95，P均＞0.05）。

2.3 不同影响因素的DLBCL患者预后分析见表2

表2 不同影响因素的DLBCL患者预后分析/月

由表2 可见，GCB 亚型患者的OS 和PFS 长于non-GCB 亚型，差异均有统计学意义（χ2分别=13.16、12.39，P均＜0.05）；联合利妥昔单抗方案化疗患者的OS 和PFS 均长于未联合利妥昔单抗方案化疗患者，差异均有统计学意义（χ2分别=4.18、4.72，P均＜0.05），CDC6 蛋白阳性表达患者的OS 和PFS 短于CDC6 蛋白阴性表达患者，差异均有统计学意义（χ2分别=6.96、7.25，P均＜0.05）。

3 讨论

细胞异常增殖是肿瘤发展的核心过程，CDC6是整个细胞周期中DNA 复制G1/S 过程的关键调节步骤，通过正性调控DNA 复制，参与组装完成“复制前复合体”[9]，控制细胞从G1 期进入S 期。研究认为，在G1 期，CDC6 在细胞核内聚集，并与复制起始复合物结合，进而启动DNA 复制；进入S 期，CDC6被异位至细胞质，以此确保DNA 复制不被重复启动。本次研究通过免疫组化检测发现，CDC6 蛋白阳性着色主要定位在细胞核及细胞质中，与既往研究相一致[10]。

本次研究显示，DLBCL 组织的CDC6 蛋白阳性率较淋巴结反应性增生组织明显升高（P＜0.05），提示CDC6 可能在DLBCL 的发生发展中发挥重要作用。CDC6 不仅是DNA 复制的必需调节因子，并且在细胞周期检查点机制的激活和维持中起重要作用，CDC6 过表达状态可加快肿瘤细胞增殖，并能修复肿瘤受损细胞周期，同时抑制其凋亡，进而造成肿瘤细胞失控性增殖，与肿瘤发病及进展关系密切[11]。Mahadevappa 等[12]研究显示，乳腺癌组织中CDC6 表达上调，且CDC6 高表达者预后不良。赵博超等[13]研究发现CDC6 在胃癌组织中的阳性表达水平明显升高。罗志飞等[14]采用免疫组织法检测了结肠癌中CDC6 的表达情况，发现CDC6 高表达与结肠癌患者的淋巴结转移数量、临床分期及远处转移密切相关，CDC6 高表达者预后不良。CDC6 有望成为肿瘤治疗的新靶标，但CDC6 是否参与DBCBL 的发生发展，至今罕见相关研究报道。

DLBCL 是一类高度异质性的侵袭性肿瘤，在发病机制、病理形态及临床表现上均有较大差异。本次研究显示，GCB 亚型患者的OS及PFS均明显长于non-GCB 亚型患者，联合使用利妥昔单抗方案化疗可延长患者的OS 及PFS（P均＜0.05），表明non-GCB 亚型预后相对较差，联合使用利妥昔单抗化疗可改善DLBCL的预后。

本次研究还发现non-GCB 亚型患者的CDC6 蛋白阳性率明显高于GCB 亚型患者，提示CDC6 蛋白可能与non-GCB 型DLBCL 患者的较差预后有一定关系，但是具体机制还需进一步研究。同时，本次研究还显示，CDC6 蛋白阳性患者的平均OS 及PFS 均明显短于CDC6 蛋白阴性患者（P均＜0.05），提示CDC6蛋白阳性预后不良，由此推测通过测定组织中的CDC6蛋白表达情况将利于临床诊断DLBCL，并可能为临床制定、调整治疗方案提供一定的依据。

综上所述，CDC6 蛋白在DLBCL 中的表达高于淋巴结反应性增生组织，CDC6 蛋白在non-GCB 亚型中的表达高于GCB 亚型；CDC6 蛋白阳性的DLBCL 患者可能预后不良。通过检测CDC6 蛋白的表达揭示了CDC6可能作为癌基因在DLBCL的发生发展中发挥重要作用，研究CDC6 对于DLBCL 的诊断及治疗均具有重大意义。但是本次研究中患者数量有限，研究结果可能存在一定的误差，后续还需扩大样本量进一步研究并综合分析。此外，未来将构建CDC6 过表达和小干扰RNA 慢病毒表达载体，并转染B细胞DLBCL 细胞株SUDHL4，过表达或敲低CDC6 的表达，初步探讨CDC6 调控细胞增殖和凋亡的机制。