西瓜枯萎病生防菌研究进展

（1.德州市农业科学研究院，山东，253015；2.德州市农业综合执法支队；3.河北农业大学园艺学院）

目前针对西瓜枯萎病的防治方法主要有农业防治、化学防治和生物防治等。 农业防治是利用农业生产过程中的各种管理或栽培措施来防治病虫害。 西瓜枯萎病农业防治主要是采取嫁接和轮作，但嫁接技术难度大，全部依赖于人工，劳动力成本高， 且砧木的类型和嫁接方式会影响果实品质；另外，轮作需要的耕地面积较大，在土地资源有限的情况下难以实现；而培育西瓜抗枯萎病品种，需要的时间长，经济投入大，且选育出的品种一般不能抗所有的生理小种，适用性较窄。 化学防治是利用化学杀菌剂来防治病原菌， 长期使用易产生抗药性，造成农药残留，易对环境产生污染。生物防治主要是利用对病原菌有拮抗作用的生防菌来降低病菌数量达到防控目的，因其安全有效，目前已成为新的研究热点[5]。 近年来利用生防菌防治西瓜枯萎病的研究取得了较大进展，本文将从西瓜枯萎病生防菌的获得、鉴定、生物防效，存在的问题及展望作简要综述，旨在为西瓜枯萎病生防菌的开发利用提供一定的参考。

1 生防菌的获得

1.1 生防菌的来源

1.2 生防菌的分离与筛选

从土壤中获得的微生物数量多， 种类复杂，需要对其进行分离和筛选。微生物的分离主要有稀释涂布法和平板划线法。稀释涂布法的目的是将单一菌株从混杂的微生物群体中分离出来，首先将土壤进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的土壤溶液分别涂布在培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 平板划线法的目的是纯化菌种，挑取单一菌落划线接种在培养基上，保证同一个菌落是由同一个细胞分裂、繁殖产生的后代。 分离纯化后的菌株还需经过进一步的筛选才能利用。生防菌的筛选主要使用平板对峙法。 初筛是在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中央放置5～7 mm 的FON 菌饼，在其外周等距接种供试菌株， 培养一段时间后观察菌丝拮抗情况；复筛则是将初筛得到的拮抗菌经过培养过滤得到无菌发酵液，进行平板对峙试验，也可以使用拮抗菌滤液制成培养基计算抑菌率。平板对峙法产生拮抗作用，可能与生防菌所分泌的蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等酶相关[16]。 王亚娇等[17]采取平板对峙法共选取抑菌带大于4 mm 的60 个拮抗菌， 结合盆栽防效测试，得到综合性好的菌株SFJ11。 岳菊等[18]通过平板对峙法得到7 株对4 种病原菌有较强拮抗作用的菌株。 也有研究人员利用肉汤琼脂培养基进行平板对峙试验， 从海洋海绵共生菌和土壤样品中初步筛选到具有明显拮抗活性的菌株共6 株[19]。

2 生防菌的鉴定

经过筛选的生防菌，需要进行进一步的鉴定分类，确定其在进化中的地位，以便加以利用。微生物传统的鉴定方法有形态学分类法和生理生化鉴定法。形态学分类法是通过显微镜观察，参考《常见细菌系统鉴定手册》[20]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[21]等专业手册，基于菌种细胞的形态、大小、排列、运动性、特殊构造和染色反应及菌落形态、在培养基中的生长状态等形态指标进行鉴定分类的一种方法；生理生化鉴定法是利用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。这2 种方法是最基础的鉴定方法，适用于所有微生物。

曹云娥等[15]参考《常见细菌系统鉴定手册》，以菌株WQ-6 单菌落在培养初期边缘整齐，表面有光泽，培养后期边缘呈锯齿状，四周隆起等形态学特征和菌株在淀粉水解、甲基红试验中呈阳性等生理生化试验结果， 初步鉴定WQ-6 菌株属芽孢杆菌属。 王卿[13]参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，根据拮抗菌株菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色菌株以及11项生化检测，初步判定所筛拮抗菌Jaas ed2 为多黏类芽孢杆菌，Jaas ed3 为枯草芽孢杆菌。冯翠娥[22]将从砂瓜种植大田土壤中分离筛选得到的拮抗菌进行形态特征观察和生理生化试验， 初步判断筛选的菌株XS-4、XS-20-15 均属芽孢杆菌属。传统的鉴定方法是目前最基础、最广泛使用的方法，但是存在一些问题：对人员素质要求较高，需要由专业知识丰富和有长期鉴别经验的人来操作， 且传统方法指标多，工作量大，耗时长，鉴定准确性差，一般只能鉴定到属， 对于相似菌株容易产生鉴定偏差， 因此菌株鉴定需要结合现代分子生物学技术进行。

3 生防菌的生物防效

虽然经筛选鉴定出的菌株具有拮抗效果，但不能确保为最优的实用菌株，在植株根部的定殖能力决定其在实际应用中的生防效果，需要进行进一步的生物防效测定。测定拮抗菌的生物防效分为室内盆栽试验和大田试验，室内盆栽试验一般以西瓜幼苗作为试验材料，在盆栽基质中注入拮抗菌和FON液测试防治效果，一般试验时间较短，在注入后15 d左右进行观察。 大田试验一般是室内试验结束后，将较为成熟的拮抗菌制成相应的生物制剂，在连作瓜田中进行测试，一般时间较长，要进行几茬西瓜的比较。陆楚月等[27]在大棚盆栽试验条件下，以2～3片真叶西瓜苗为试验材料，测试绿色木霉对西瓜枯萎病的防控效果，防效为60%；纪明山等[28]将拮抗木霉和拮抗细菌制成不用浓度的生物制剂，分别在室内和田间进行生物防效测定，防效最高可达76.78%和76.79%；王丽丽等[29]用灌根法测试了不同浓度菌株15 发酵液对出苗10 d 的西瓜苗的影响，防效为42.3%。 测定生物防效时，除了直接接种拮抗菌外，还可将生防菌与有机肥混合发酵，或制成生物菌剂施用。

生防菌主要是通过降低致病菌的数量来抑制枯萎病的发生，也有些生防菌是通过促进西瓜对营养元素的吸收来提高植株自身抗性，从而达到抑制枯萎病的效果。 经试验验证，瓜田接种一定量的丛枝菌根菌能有效改善西瓜植株对氮、磷、硼、锌等矿质营养的吸收，特别是能促进西瓜对土壤中矿质态磷素的吸收[30]。 研究还表明，有些生防菌是通过次生代谢物或者提高酶活性来增强植物抵抗力，西瓜植株根部分泌酚酸和有机酸的量会影响枯萎病的发生率[31]，解淀粉芽孢杆菌通过次生代谢产物表面活性素诱导植物产生早期免疫反应，并增强对病原菌的抵抗能力[32]。 研究表明，先施加解淀粉芽孢杆菌B6， 能诱导西瓜幼苗SOD 和POD 酶活升高，再施加尖孢镰刀菌，幼苗中SOD 和POD 酶活会更早、更强烈地表达，激发幼苗抵抗病原菌的潜力[33]。

4 存在的问题及展望

生物防治被认为是对环境最友好的防治措施之一，目前国内外已经有很多研究报道，其中有些生防菌已成功应用于生产，例如由水谷欣生物科技有限公司生产的含有枯草芽孢杆菌的西瓜专用菌剂在苗期对西瓜枯萎病的防效高达94.9%，由青岛地恩地生物科技有限公司生产的放线菌菌剂对西瓜枯萎病的防效达到90.9%[1]。 利用拮抗微生物防治西瓜枯萎病，不仅可以降低环境污染，还能缓解病原菌的抗性，促进植物生长，增加西瓜产量。虽然生防菌因对环境安全无污染而成为目前研究的热点，但还是面临着很多问题。例如，同一种生防菌在室内抑制效果比大田更稳定可靠，原因主要是相对于室内环境，大田环境较复杂，易受土壤条件、环境变化、微生物种群数量和种类的影响，使得很多生防菌在大田防治中效果较差或者表现不稳定。 此外， 生防菌对西瓜枯萎病的拮抗机制并不明确，而且对其本身的风险性评价较少，获得的拮抗菌不能很好地应用。 针对这些问题，研究者可以在今后的工作中着手筛选稳定、 高效并具有广谱性的菌株，筛选适合生防菌存活的基质， 提高生防菌在土壤环境中的定殖能力和存活时间。 此外，因拮抗菌无法直接接种到大田中，可以在不降低拮抗菌生物活性的前提下将其制成可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂和种衣剂[34～36]，也可接种到生物有机肥中[37，38]，提高应用效果。 研究者还可以结合现代生物技术，加强对西瓜枯萎病的生防菌研究，注重生防菌的田间防效，发掘生防菌的防治潜力，提高生产应用价值，逐渐取代部分化学农药的使用，实现低成本、安全、无污染、增产增质的目标，促进西瓜枯萎病的生物防治取得突破性进展。