和田羊Lin28B基因启动子区的克隆及序列分析

隋志远，张继虎，李庆瑾，张志帅，张永杰，邢 凤

（塔里木大学动物科学与技术学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

初情期为雌性动物初次发情并发生排卵的时期，与下丘脑－垂体－性腺轴的调控，环境和遗传因素对黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的协调功能的相互作用有关[1-5]。初情期在动物生长发育中占据极为重要的地位，是动物获得繁殖能力的一个重要的标志，其出现的时间与动物繁殖力有直接的关系[6]。初情期受多种因素的影响，其中包括遗传机制、营养水平和光照时间等均会影响初情期的时间[7-9]。研究表明，下丘脑中的神经肽Y和瘦素系统[10]、神经激素B系统[11]、γ-氨基丁酸系统[12]和Lin28系统[13]等在初情期的启动过程中发挥着重要作用。Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，最早发现于秀丽隐杆线虫中，是调节线虫发育时间（从幼虫到成虫的转变过程）的异时基因[14]。在线虫中，只有一种Lin28，而在哺乳动物中，存在Lin28A和Lin28B两种同源基因。Lin28A和Lin28B都含有两个RNA结合结构域：一个冷休克结构域（Cold Shock Domain,CSD）和一对CCHC锌指结构域，Lin28A和Lin28B具有相同的功能，呈现不同的细胞类型分布[15]。Lin28B基因首先在人肝细胞癌中克隆出来，位于6号染色体上，其mRNA具有非常长的3′UTR，有let-7miRNA的互补位点[15]。Lin28B基因位于绵羊的8号染色体，邢凤等通过克隆测序获得了多浪羊Lin28BmRNA序列的两个转录本。通过对比发现，两个转录本具有不同的编码区和5′UTR。其中转录本1为6 630 bp，包含1 396 bp的5′UTR、744 bp的整个编码区和4 490 bp的3′UTR；转录本2为5 271 bp，包含13 bp的5′UTR、768 bp的整个编码区和4 490 bp的3′UTR[16]。

启动子通常位于结构基因5′端上游，是RNA聚合酶识别并特异性结合模板DNA上的一段核苷酸序列，保证转录起始的精准性[17]。目前，国内外还未有与绵羊Lin28B基因启动子区的相关研究，为初步探究启动子区域对Lin28B基因转录调控的重要意义，本研究将通过PCR扩增及克隆测序技术，获得和田羊Lin28B基因启动子区序列，并采用生物信息学方法对该序列进行预测分析，从而为深入研究Lin28B基因在绵羊初情期启动中的转录调控机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取新疆维吾尔自治区和田市和田惠民畜牧科技有限公司雌性6月龄的和田羊34只，颈静脉采血10 mL，EDTA-K抗凝处理（血液与EDTA-K为5:1（V/V））,置-20℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)均购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker、2× EasyTaq PCR SuperMix(+dye)、DH5α均购自北京全式金生物技术有限公司；pMD19-T vector购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

参照DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）说明书对和田羊血液基因组DNA进行提取，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，用紫外分光光度计检测含量。将检测合格的DNA统一浓度为200 ng/μL，各取5 μL进行DNA混池构建，放置-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

在 Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）上查找Lin28B的基因组参考序列（ID:ENSOARG00000011404），以 5′UTR 上游序列约3 000 bp为模板，所有引物均使用Primer Premier 6.0软件设计（表1）并送至上海生工生物工程有限公司进行合成。

表1 启动子扩增引物Table 1 Primers for amplification of promoter

1.2.3 和田羊Lin28B基因启动子区的PCR扩增和克隆

以和田羊血液基因组DNA为模板，对Lin28B基因启动子区进行PCR扩增，PCR扩增体系(25 μL)：基因组DNA 1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，无菌去离子水(ddH2O）9.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸10 min。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，使用胶回收试剂盒对目的片段进行回收，连接到pMD19-T Vector载体上，构建重组质粒pMD19-T-Lin28B，然后转化至大肠杆菌DH5α中培养过夜，经蓝白斑筛选之后挑取白色阳性克隆子，经菌液PCR鉴定成功后将5个阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行测序。使用DNAMAN 6.0软件和NCBI Blast对测序结果进行比对分析，鉴定序列的正确性。

1.2.4Lin28B启动子区的序列结构预测分析

测序获得的Lin28B基因启动子区序列的峰图用分子生物学软件Chromas进行校对，用DNAMAN 6.0进行序列拼接。利用在线软件Neural Network Promoter Prediction（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）预测Lin28B启动子区转录起始位点；利用LASAGNA-Search 2.0（https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/）对Lin28B基因启动子区所有的转录因子结合位点进行预测；利用在线软件FPROM（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fpro-m&group=programs&subgroup=promoter）预测TATA-box 和 CAAT-box；利 用 Methprimer（http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi）和 EMBOSS Cpgplot（http://emboss.bioinformatics.nl/cgibin/emboss/cpgplot）两个在线软件对Lin28B基因启动子区进行CpG岛预测。

2 结果与分析

2.1 和田羊Lin28B基因启动子区序列的扩增和克隆

利用设计好的特异性引物，以1 μL的34只和田羊DNA混池为模板，PCR扩增结果（图1），并对扩增产物进行克隆测序。

图1 和田羊Lin28B基因启动子区扩增产物电泳结果Figure 1 The PCR amplification result of Hetian sheep Lin28B promoter

通过DNAMAN软件对测序结果进行拼接，对比分析发现，测序结果不存在多态性，目的片段大小分别为887、1 117和1 200 bp，去除重叠序列，获得和田羊Lin28B基因启动子区2 993 bp（图2）。和田羊Lin28B启动区序列碱基构成为A 834 bp、占27.87%，T 987 bp、占32.98%，C 589 bp、占19.68%，G 583 bp、占19.47%。在整个序列中，AT含量相对较高，占60.67%，CG含量占39.33%，相差约21%。

2.2 和田羊Lin28B基因启动子区序列生物信息学分析

通过在线软件Neural Network Promoter Prediction进行预测发现，和田羊Lin28B基因启动子区存在7个潜在的转录起始位点（图2）。通过启动子在线软件LASAGNA-Search 2.0预测发现，所获的和田羊Lin28B基因启动子区存在多个转录因子作用元件，如Oct-1、p53、Pax-4、STAT3、TGIF等识别位点，总计57个，其中，STAT3结合位点频率较高（表2）。通过FPROM在线软件分析可知，和田羊Lin28B基因启动子区具有典型的真核生物启动子结构元件和序列特征，含有2个TATA-box（图2）。通过Methprimer（预测条件：CpG岛长度＞100 bp、GC含量＞50%、ObsCpG/ExpCpG＞0.6）预测发现，和田羊Lin28B基因启动子区有2个CpG岛（图3）分别位于-752～-604 bp和-244～-142 bp。通过EMBOSS Cpgplot（预测条件：CpG岛长度＞100 bp、GC含量＞50%、ObsCpG/ExpCpG＞0.6）预测发现和田羊Lin28B基因启动子区有2个CpG岛（图4）分别位于-752～-604 bp和-244～-142 bp。两个在线软件对于Lin28B基因启动子区CpG岛的预测结果完全一致。

图2 和田羊Lin28B基因启动子序列与结构Figure 2 Sequence and structure in the promoter region of Hetian sheep Lin28B gene

图3 CpG岛预测结果（Methprimer）Figure 3 CpG island predicitions results Lin28B gene(Methprimer)

图4 CpG岛预测结果（EMBOSS Cpgplot）Figure 4 CpG island predicitions results Lin28B gene(EMBOSS Cpgplot)

表2 和田羊Lin28B基因启动子区主要转录因子结合位点（分数≥10）Table 2 Putative main transcription factor binding sites in the promoter region of Hetian sheep Lin28B gene(score≥10)

3 讨论与小结

初情期是动物繁殖能力开始的时期，同时初情期的早晚也与动物的繁殖能力相关[16]。初情期早的动物，繁殖能力较高，终身繁殖的后代数较多。人们研究证实，Lin28B和家畜的初情期的mRNA表达具有一定的相关性。Sangiao-Alvarellos等研究发现Lin28B基因mRNA在新生雌、雄大鼠下丘脑中大量表达，在幼年期到初情期的过渡中，Lin28B基因表达急剧下降[18]。雌性恒河猴下丘脑Lin28B基因在从幼年期到达初情期的发育过程中表达显著下降。邢凤等[19]研究表明Lin28BmRNA在和田羊下丘脑、垂体、卵巢组织中均有表达。很多转录调控元件位于基因启动子区，这些元件与基因的转录有着密切的联系。

真核生物的启动子常包含TATA-box、CAAT-box和GC-box等作用元件。为了探究和田羊Lin28B基因与初情期性状相关转录调控机制，本试验克隆所得和田羊Lin28B基因启动子区序列长2 993 bp，在此序列中发现2个TATA-box、2个CpG岛。其中，第二个TATA-box位于转录起始位点上游25～30 bp[20]，且与第二个CpG岛的区域相一致，但未发现CAAT-box。

研究表明，转录水平上的基因调控是通过TFBS DNA序列结合，使得启动子与TFs之间相互作用[21]。因此，本试验通过LASAGNA-Search 2.0在线软件分析发现，和田羊Lin28B启动区序列包含57个转录因子结合位点，Oct-1、p53、Pax-4、STAT3、TGIF等转录因子的结合位点频率较高。除此之外，该序列还包含结合频率较低的MEIS1、STAT5B转录因子。相关研究表明，p53[22]家族包括3个转录因子p53，p63和p73。在大鼠中，p53过表达可能部分通过c-Myc/Lin28/let-7系统加速下丘脑-垂体-性腺轴的激活来影响大鼠初情期来临的时间[23]。STAT家族包括STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6[24]。而STAT6、STAT5转录因子对小鼠和牛的初情期发育时间和生长的调控有影响[25-26]。GPR54是调节初情期开始的重要因子，而牛的EGR1通过ATC启动子结合位点诱导GPR54转录[25-26]。MEIS1可能在支持细胞介导的男性青春期及青春期后精子发生调控中发挥重要作用[28]。所以推测，结合位点频率较高的p53、STAT3和结合频率较低的MEIS1、STAT5B可能与初情期的调控有一定的关系。

综上，本研究成功克隆了和田羊Lin28B基因启动子区序列，其序列长度为2 993 bp,包含1个TATA-box和2个CpG岛。通过预测发现，该序列还包括57个转录因子，其中p53、STAT3、MEIS1和STAT5B可能与初情期的调控有一定的关系。通过对和田羊Lin28B基因启动子序列的初步分析，为Lin28B基因转录调控的机制研究奠定了基础。